豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)方法與常規(guī)檢測(cè)方法的比較

宋 立，高志強(qiáng)，楊承槐，寧宜寶，張鶴曉，吳 丹，張利峰，劉 洋

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026)

目前臨床常用檢測(cè)豬鏈球菌的方法有細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR方法［1］。細(xì)菌分離培養(yǎng)是傳統(tǒng)的診斷、檢測(cè)方法，所需時(shí)間較長(zhǎng)，鑒定相對(duì)有一定難度。常規(guī)PCR方法不能定量，敏感性不夠高。熒光PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)檢測(cè)新技術(shù)，其原理是將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，并能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知核酸模板進(jìn)行定量分析。由于該項(xiàng)技術(shù)克服了常規(guī)PCR不能定量檢測(cè)的缺點(diǎn)，且特異性和敏感性較常規(guī)PCR大幅提高，因此在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域均得到廣泛運(yùn)用［2－4］。

致病性豬鏈球菌2型為人畜共患傳染病病原菌，在動(dòng)物中可引起豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和敗血癥等。該病原致病性強(qiáng)、傳播迅速，如果不及時(shí)治療，可導(dǎo)致發(fā)病動(dòng)物急性死亡。豬鏈球菌病在我國(guó)各地時(shí)有發(fā)生，在局部地區(qū)呈暴發(fā)勢(shì)態(tài)［5－6］，并常有感染人類(lèi)的報(bào)道［7－8］，給人類(lèi)健康帶來(lái)威脅。因此，選擇一種快速、靈敏的檢測(cè)方法用于臨床樣品檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)帶菌食品和動(dòng)物，對(duì)于豬鏈球菌病的及時(shí)預(yù)防和畜產(chǎn)品進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫均有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

1.1.1.1 豬鏈球菌2型R735 由加拿大特利爾大學(xué)Marcelo Gottschalk教授惠贈(zèng)，試驗(yàn)濃度CFU為42 ×106/0.1 mL。

1.1.1.2 豬鏈球菌2型C55606 從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種中心領(lǐng)取，試驗(yàn)濃度CFU為52×106/0.1 mL。

1.1.1.3 豬鏈球菌四川株 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2005年從四川豬鏈球菌2型發(fā)病豬體內(nèi)分離，經(jīng)API Strep拭條鑒定為豬鏈球菌2型。

1.1.2 試驗(yàn)小鼠和豬 小鼠為1月齡小白鼠，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障室提供。豬為廣東永順生物制藥有限公司動(dòng)物場(chǎng)飼養(yǎng)的二元長(zhǎng)白(♂)與香豬(♀)的雜交一代，均為45日齡，體重20 kg。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)臨床樣品檢測(cè)的敏感性和實(shí)用性比較

1.2.1.1 對(duì)發(fā)病小鼠樣品的檢測(cè) 用豬鏈球菌2型四川株馬丁肉湯20 h新鮮培養(yǎng)物，腹腔注射1月齡小鼠，每只1 mL，約3800個(gè)菌，攻菌后2 d死亡2/5。無(wú)菌取出死亡小鼠肝臟，與陰性對(duì)照小鼠肝臟一同用熒光PCR檢測(cè)方法和常規(guī)細(xì)菌分離法檢測(cè)病原，比較兩種方法的敏感性和實(shí)用性。

1.2.1.2 對(duì)發(fā)病豬樣品的檢測(cè) 用豬鏈球菌2型HA9801株(廣東永順生物制藥有限公司制備，疫苗檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株)攻擊試驗(yàn)用豬4頭(1#、2#、3#和4#)，每頭1.74 ×107CFU。1#和2#豬感染瀕死后，馬上剖殺取臟器;3#豬攻毒后48 h死亡，死亡后24 h剖殺取臟器;4#豬攻菌后66 h死亡，死亡后6 h解剖取臟器。用熒光PCR檢測(cè)方法、常規(guī)PCR方法和細(xì)菌分離法對(duì)感染豬的臟器(心、肝、脾、腎、扁桃體實(shí)質(zhì)臟器和血液、喉拭子)進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)陰性對(duì)照，比較3種方法對(duì)臨床樣品的敏感性和實(shí)用性。1.2.1.3 熒光PCR檢測(cè)方法 用北京出入境檢驗(yàn)檢疫局和中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備的豬鏈球菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為2005002，按使用說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。

1.2.1.4 常規(guī)細(xì)菌分離法 首先將樣品分別接種于綿羊血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)40 h，長(zhǎng)出的可疑菌落用豬鏈球菌2型陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，能被特異性陽(yáng)性血清凝集的為陽(yáng)性，不能被凝集的為陰性。

1.2.1.5 普通PCR檢測(cè)方法 上游引物Cps2J－s，5’－ GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T －3’;下游引物Cps2J－as，5’－CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C－3’。目的片段長(zhǎng)度為450 bp左右。

1.2.2 檢測(cè)靈敏度的比較 將豬鏈球菌2型R735、豬鏈球菌2型 C55606分別稀釋至10－9，用熒光PCR和常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并做細(xì)菌CFU測(cè)定，比較檢測(cè)靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的判定 Ct值≤35.0，且擴(kuò)增曲線出現(xiàn)特異性指數(shù)擴(kuò)增區(qū)，則為豬鏈球菌2型陽(yáng)性;無(wú)Ct值或無(wú)特異性指數(shù)擴(kuò)增區(qū)，則為豬鏈球菌2型檢測(cè)陰性(圖1)。

圖1 豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)示意圖

2.2 PCR檢測(cè)結(jié)果的判定 電泳出現(xiàn)450 bp左右條帶的判為陽(yáng)性，否則為陰性(圖2)。

圖2 豬鏈球菌2型PCR檢測(cè)示意圖

2.3 對(duì)發(fā)病小鼠樣品檢測(cè)結(jié)果的比較 2只發(fā)病小鼠肝臟組織熒光PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，而對(duì)照呈陰性。與常規(guī)細(xì)菌分離法檢測(cè)結(jié)果一致。

2.4 對(duì)發(fā)病豬樣品檢測(cè)結(jié)果的比較 用細(xì)菌分離法對(duì)1#～4#豬細(xì)菌分離結(jié)果如表1所示。病死后立即取出的病料樣品，細(xì)菌分離法檢出率為100%;死亡數(shù)小時(shí)后才取出的病料樣品，細(xì)菌分離率大幅下降。3種方法對(duì)2#～4#豬病料的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明對(duì)于病死后不同時(shí)間采到的病料樣品，熒光PCR方法的檢測(cè)率最高，為70.8%(17/24)，其次是細(xì)菌分離法45.8%(11/24)，常規(guī)PCR方法檢出率最低，為20.8%(5/24)。

2.5 靈敏度檢測(cè)結(jié)果的比較 將 10－5、10－6、10－7和10－8每個(gè)稀釋度取0.1 mL接種于血平板，37℃培養(yǎng)40 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算CFU。結(jié)果R735株CFU為42×106/0.1 mL;C55606株CFU為52×106/0.1 mL。熒光 PCR 檢測(cè)滴度可達(dá) 10－6，而普通PCR僅能達(dá)到10－4。

表1 1#～4#豬病料細(xì)菌分離結(jié)果

表2 3種方法對(duì)2#～4#豬病料的檢測(cè)結(jié)果

3 分析與討論

3.1 從常規(guī)的細(xì)菌分離法來(lái)看，1#和2#豬死亡后及時(shí)采樣，血液以及其他實(shí)質(zhì)器官和喉拭子均長(zhǎng)出α溶血的鏈球菌可疑菌落，長(zhǎng)菌量排列依次為血→肺和脾→肝和扁桃體→喉拭子→心和腎，用特異性陽(yáng)性血清鑒定，均為豬鏈球菌2型。但在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，除血外，其他樣品還長(zhǎng)出少量雜菌，表明臨床樣品通常存在其他細(xì)菌的污染。3#和4#豬攻菌死亡后未及時(shí)采樣，心、脾、腎、肺、扁桃體和喉拭子以長(zhǎng)出淺綠色、濕潤(rùn)、圓形、中等大小菌落為主，有β溶血環(huán)，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌落為G－桿菌，初步判斷為綠膿桿菌。由于該菌生長(zhǎng)速度快，幾乎覆蓋了豬鏈球菌的生長(zhǎng)。只有4#豬血液能長(zhǎng)出一些α溶血的被檢菌落，肝和肺見(jiàn)到少量被檢菌。該試驗(yàn)充分說(shuō)明傳統(tǒng)細(xì)菌分離法操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)被檢樣品純凈度要求較高，污染雜菌則檢出率會(huì)大幅下降，但臨床樣品很難做到不受其他細(xì)菌的污染。

3.2 從表2的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)方法具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。24份臨床感染豬器官樣品，該方法檢出率為70.8%，普通PCR法檢出率僅為20.8%，所以該方法敏感性高于普通PCR方法。常規(guī)細(xì)菌分離法為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，檢出率也只為45.8%，主要由于臨床樣品受其他細(xì)菌污染，生長(zhǎng)較快的雜菌很快把豬鏈球菌覆蓋。用熒光PCR檢測(cè)方法，幾乎不受雜菌污染的限制，所以熒光PCR這一新型的檢測(cè)技術(shù)，是在普通PCR原有一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加特異性的熒光雙標(biāo)記探針，在儀器上通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)累計(jì)的感應(yīng)和信息處理，使抗原核酸呈特異性S型擴(kuò)增曲線表示出來(lái)，使其在普通PCR基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了對(duì)病原體檢測(cè)的特異性、敏感性和靈敏度，并能定量分析。在樣品帶菌狀況監(jiān)測(cè)和進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫中，該方法快速、靈敏、操作方便，完全可以取代常規(guī)細(xì)菌分離法。但該方法只能做病原核酸的檢測(cè)，如需分離病原做進(jìn)一步調(diào)查研究，就必須采用經(jīng)典的細(xì)菌分離法。

3.3 對(duì)于豬鏈球菌2型實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的菌液，熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度也明顯高于常規(guī)PCR方法，熒光PCR檢測(cè)滴度可達(dá)10－6/0.1 mL(42～52 CFU/0.1 mL);而普通PCR僅能達(dá)到10－4。

致謝:廣東永順生物制藥有限公司為本試驗(yàn)提供了陽(yáng)性豬和陰性豬樣品，在此感謝王少英總工的無(wú)私幫助和支持。

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