四君子湯提取工藝優(yōu)化研究

張挪威，萬(wàn)長(zhǎng)榮，趙 宏，閆秋會(huì)，朱曉宇，徐霄龍，許劍琴

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193;2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技系，北京 102206;3.農(nóng)業(yè)部獸用化藥和中草藥創(chuàng)制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

四君子湯源于宋代《太平惠民和劑局方》，由黨參(原方為人參)、白術(shù)、茯苓(去皮)、甘草(炙)四味基本中草藥組成，主治脾胃氣虛［1］。研究結(jié)果證實(shí)四君子湯具有誘導(dǎo)裸小鼠移植性人胃癌細(xì)胞凋亡和抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［2－3］，可以通過(guò)調(diào)節(jié)小腸細(xì)胞因子的表達(dá)改善利血平誘導(dǎo)的脾虛大鼠黏膜免疫功能［4］和脾虛狀態(tài)下對(duì)藥物的吸收［5］。四君子湯總多糖和四君子湯去蛋白多糖可改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能抑制、促進(jìn)腸道黏膜免疫功能恢復(fù)［6］，在促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù)方面也有一定的作用。目前關(guān)于四君子湯最優(yōu)水提工藝的研究還缺少詳細(xì)報(bào)道。為建立科學(xué)合理的提取工藝，進(jìn)一步推動(dòng)四君子湯的臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)，本研究根據(jù)處方中藥材有效成分的理化性質(zhì)和藥理作用，以四君子湯中主要藥效成分之一甘草酸的提取量為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)藥物浸泡時(shí)間、加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)加以考察，對(duì)四君子湯的水提工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.1.2 試劑 甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110731－200615);黨參、白術(shù)、茯苓和甘草(炙)購(gòu)于北京同仁堂藥店，經(jīng)鑒定為《中國(guó)藥典》收載品種;甲醇、醋酸銨、冰醋酸為色譜純?cè)噭渌噭┚鶠榉治黾儭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1 因素水平的選擇 本處方選取浸泡時(shí)間、加水量、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)作為考察因素，各因素取3個(gè)水平(表1)，按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳工藝條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選四君子湯煎煮工藝

1.2.1.2 正交試驗(yàn)樣品制備 黨參、白術(shù)、茯苓和甘草按照2∶2∶2∶1的質(zhì)量比稱(chēng)取后混合，按照表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案水煎提取，提取液混合后真空抽濾和放冷，置200 mL量瓶中備用。

1.2.2 甘草酸單銨鹽的測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，檢測(cè)器Serial No:DE64262691，甲醇－1% 醋酸銨溶液－冰醋酸(64∶36∶1)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，檢測(cè)理論板數(shù)不低于3000。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相制成每1 mL分別含0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg 甘草酸單銨鹽溶液，0.22 μm孔徑過(guò)濾，即得。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取各步正交試驗(yàn)所煎煮的四君子湯5 mL，加入等體積的雙蒸水稀釋?zhuān)瑩u勻，0.22 μm 孔徑濾過(guò)，即得。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別精密吸取不同濃度的甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣量為 10 μL，流動(dòng)相流速 1 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)時(shí)間13 min，檢測(cè)信號(hào)波長(zhǎng)250 nm。按1.2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，測(cè)定其峰面積，以進(jìn)樣樣品對(duì)應(yīng)甘草酸單銨鹽質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，以甘草酸單銨鹽峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得線(xiàn)性回歸方程Y=9.38+699.66X，相關(guān)系數(shù)R=1。

1.2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液 10 μL(濃度為 0.1959 mg/mL)，按1.2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。RSD=0.47%，表明儀器精密度良好。

1.2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將同一甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別于 0、3、6、10 h 進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定峰面積。RSD=1.17%，表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液穩(wěn)定性良好。

1.2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批四君子湯煎劑5份，按 1.2.2.3 項(xiàng)中的方法制備供試品溶液，按1.2.2.1項(xiàng)中的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算甘草酸單銨鹽提取量。RSD=1.69%，表明重復(fù)性良好。1.2.2.8 實(shí)驗(yàn)樣品和陰性對(duì)照品的測(cè)定 分別精密吸取甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液各10 μL注入色譜儀測(cè)定，并根據(jù)1.2.2.4項(xiàng)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程求甘草酸單銨鹽提取量，結(jié)果如表2所示。

1.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按基本處方稱(chēng)取黨參等藥材3批，對(duì)上述正交試驗(yàn)所得提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，即按第2水平制備四君子湯煎劑3批，測(cè)定煎劑中甘草酸單銨鹽提取量。結(jié)果表明，最佳煎煮條件可靠，方法可重復(fù)操作。

2 結(jié)果及分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取9份正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)樣品分別測(cè)定甘草酸單銨鹽提取量。在實(shí)驗(yàn)色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中甘草酸單銨鹽出峰時(shí)間在7.25 min左右，與樣品(圖1)能達(dá)到基線(xiàn)分離，沒(méi)有干擾。各正交水平實(shí)驗(yàn)中四君子湯甘草酸單銨鹽提取結(jié)果如表2、表3和圖1所示。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 甘草酸單銨鹽高效液相色譜圖

2.2 結(jié)果分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，綜合直觀(guān)分析和方差分析判斷各因素對(duì)提取效果的影響程度，篩選出在該試驗(yàn)條件下的優(yōu)化提取參數(shù)(表3)。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知(表4)，以甘草酸單銨鹽為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的影響順序?yàn)榧逯蟠螖?shù)＞煎煮時(shí)間＞用水劑量＞浸泡時(shí)間，其中煎煮次數(shù)對(duì)工藝有顯著影響，其他3個(gè)因素均無(wú)顯著影響，因此煎煮次數(shù)為3。而對(duì)于無(wú)顯著影響的因素，只需結(jié)合具體工作及生產(chǎn)實(shí)際要求，本著盡量選擇平均數(shù)最大的水平，最終確定為煎煮時(shí)間2 h，加10倍水，浸泡30 min。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算表

3 討論

提取工藝對(duì)藥品的安全性和有效性有著重要影響，工藝優(yōu)化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)一般應(yīng)以有效成分和已知成分為主要指標(biāo)［7］。對(duì)四君子湯研究有人以提取物中人參皂苷Rg1的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)［8］，也有以四君子湯中其他活性成分如人參總皂甙和總多糖為指標(biāo)［9］?！吨袊?guó)藥典》把甘草酸的量作為評(píng)價(jià)甘草藥材及其制品質(zhì)量的重要指標(biāo)，通常要求不低于2%［12］，現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)了160多種甘草黃酮類(lèi)化合物［10］，其中有60多種含有三萜類(lèi)化合物以及香豆素類(lèi)、氨基酸、雌性激素、有機(jī)酸等多種成分［11］。甘草酸(亦稱(chēng)甘草甜素，Glycyrrhizin)是甘草中最重要的三萜類(lèi)化合物，含量可達(dá) 3.63% ～13.06%［13］，亦為其主要活性成分，本實(shí)驗(yàn)選擇甘草的穩(wěn)定成分之一甘草酸單銨鹽作為測(cè)定指標(biāo)。有人研究煎煮時(shí)間對(duì)四君子湯某些成分的影響，指出隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，煎膏煎出率、總黃酮化合物及甘草酸在水煎液中的含量均有變化，煎煮時(shí)間由10～30 min時(shí)均呈上升趨勢(shì)，40 min及其后則呈平緩下降［14］。結(jié)合前人對(duì)四君子湯提取工藝的研究，確定選擇浸泡時(shí)間、加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)4個(gè)影響因素，并從3個(gè)水平上分別討論這4個(gè)因素的作用。在對(duì)提取方法、純化方法進(jìn)行選擇、優(yōu)化的過(guò)程中，本著可行、實(shí)用的原則，以具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，綜合統(tǒng)計(jì)分析及直觀(guān)分析得出結(jié)論，最終確定四君子湯最優(yōu)煎煮條件為:浸泡30 min，加水量10倍、煎煮時(shí)間2 h，煎煮次數(shù)為3。

致謝:本研究由教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(No.201003060－9/10)支持，感謝CAU－BUA中獸醫(yī)藥學(xué)科研教學(xué)團(tuán)隊(duì)成員提供的無(wú)私幫助。

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