煙曲霉抗原 Asp f16 HLA-A＊0201限制性的 CD8+CTL抗原表位生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)室鑒定

趙作濤 孫錚 萬(wàn)喆 朱平 李若瑜

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心,北京 100034;2.北京大學(xué)第一醫(yī)院血液科,北京 100034)

近年來(lái),隨著免疫受損患者不斷增多,侵襲性曲霉病 (Invasive Aspergillosis,IA)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),而且病情十分嚴(yán)重。在白血病和骨髓移植受者等重癥免疫受損患者中,IA患者的病死率高達(dá)90%,已經(jīng)成為此類(lèi)患者死亡的主要原因之一,而煙曲霉是 IA最主要的致病真菌[1-5]。

目前臨床主要還是以各種抗真菌藥物作為 IA的主要治療方法,鑒于 IA的患病率上升、病死率極高,而目前臨床正面臨著抗真菌藥物副作用大、治療效果不理想的險(xiǎn)峻形勢(shì),進(jìn)一步尋找更為有效的治療方法成為目前急需解決的重要問(wèn)題。大量研究表明細(xì)胞免疫,特別是 T細(xì)胞免疫在宿主清除煙曲霉感染中具有重要作用,T細(xì)胞免疫治療 IA具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景[6-14]。免疫治療 IA的最大困難在于煙曲霉的抗原成分十分復(fù)雜,篩選和鑒定合適的煙曲霉抗原表位,通過(guò)體外多肽抗原負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞 (dendritic cells,DC)誘導(dǎo)抗原肽特異性 CTL產(chǎn)生,對(duì)于研究 CTL殺傷煙曲霉的機(jī)制和多肽疫苗的制備具有重要意義。因此,本文應(yīng)用生物信息學(xué)手段對(duì)煙曲霉抗原 Asp f16進(jìn)行分析,以國(guó)人常見(jiàn)的 HLA-A＊0201位點(diǎn)為靶點(diǎn),對(duì)可能的 CTL抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),合成多肽并制備多肽特異性 CTL,應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法 (Enzymelinked immunosorbent assay,ELISPOT)技術(shù)檢測(cè)CTL產(chǎn)生的能力,四聚體 (Tetramer)流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)抗原肽特異性 CTL,從而對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的抗原表位進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步研發(fā)新型抗煙曲霉T細(xì)胞疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠 (C57BL/6背景)購(gòu)自于美國(guó) Jackson Laboratory,于 SPF環(huán)境養(yǎng)殖,轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人類(lèi) MHC-I類(lèi)分子 HLA-A＊0201[15]。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)煙曲霉抗原 Asp f16的 HLAA＊0201限制性 CTL抗原表位

利用文獻(xiàn)報(bào)道及生物信息學(xué)資源,我們從 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得煙曲霉抗原Asp f16(編碼基因 crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu 1g16190)的全部 427個(gè)氨基酸序列,使用由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)和德國(guó)Tubingen大學(xué)免疫系 (http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)提供的生物信息學(xué)軟件掃描了煙曲霉抗原Asp f16的全部 427個(gè)氨基酸序列[16]。鑒于國(guó)人常見(jiàn)的 HLA位點(diǎn)是 HLA-A＊0201,我們選擇了該位點(diǎn)作為靶點(diǎn),根據(jù)與 HLA分子穩(wěn)定性半衰期評(píng)分篩選出預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)較高的 3條 9肽 (見(jiàn)表 1)。

表 1 抗原表位生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.1 Prediction of HLA peptides motif

1.3 多肽合成

根據(jù)生物信息學(xué)軟件篩選結(jié)果,合成 3條HLA-A＊0201限制性 9肽 (P1,P2,P3)以及與煙曲霉無(wú)關(guān)的對(duì)照肽 (來(lái)源于血液腫瘤抗原核仁磷蛋白 NPM1,CLAVEEVSL)。4條多肽交予上海強(qiáng)耀生物科技有限公司 (ChinaPeptides Co.,Ltd.)合成,高效液相色譜儀 (HPLC)測(cè)定其純度 >95%。1 mg多肽溶解在 20μL的 DMSO(sigma)中,每支EP管 5μL分裝,-30℃冷凍保存。

1.4 HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠 DC的制備

HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)脫頸椎處死,浸入75%酒精中。5 min后,在生物安全柜內(nèi)無(wú)菌操作游離脛骨,置于無(wú)菌 PBS中。剪掉骨兩端,使用RPMI 1640完全培養(yǎng)液 (Hyclone,含 10%胎牛血清,青霉素 100 U/mL,鏈霉素 100μg/mL,Gibco)反復(fù)沖洗骨髓腔,將獲得的細(xì)胞懸液置于 RPMI 1640完全培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱 (Thermo)孵育。4 h后輕柔吸去懸浮未貼壁的細(xì)胞,以RPMI 1640完全培養(yǎng)液輕柔沖洗 3遍,以除去未貼壁細(xì)胞。更換新的 RPMI 1640完全培養(yǎng)液,同時(shí)加入細(xì)胞因子 GM-CSF(R＆D,終濃度 20 ng/mL)和IL-4(R＆D,終濃度 10 ng/mL)。第 4天,全量更換1次 RPMI 1640完全培養(yǎng)液。第 5天,向培養(yǎng)體系加入 TNF-α(R＆D,終濃度 10 ng/mL)。第 7天 ,收獲培養(yǎng)體系內(nèi)的細(xì)胞。

1.5 成熟 DC的表型鑒定

收集培養(yǎng)第 7天的 DC,調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×107/mL,與以下抗體孵育:FITC-Anti Mouse I-Ab(AF6-120.1),PE-Anti Mouse CD80(16-10A1);FITC-Anti Mouse CD11c(N418),PE-Anti Mouse CD86(GL-1)。對(duì)照抗體分別為:FITC-Mouse Ig2a κIsotype Ctrl(MOPC-173),PE-Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl(HTK-888),FITC-Armenian Hamster IgGIsotype Ctrl(HTK-888),PE-Rat IgG2aκI-sotype Ctrl(RTK2758),全部抗體均購(gòu)置美國(guó) Biolegend公司。將 100μL細(xì)胞 (106)與熒光單抗于4℃反應(yīng) 30 min,PBS洗 3次后流式細(xì)胞儀 (BD,LSR)檢測(cè)表型。

1.6 成熟 DC的抗原肽負(fù)載

成熟 DC分為兩組,分別加入 DMSO溶解的實(shí)驗(yàn)組多肽和對(duì)照肽組多肽,使其濃度皆為 50μg/mL,37℃,5%CO2條件培養(yǎng) 2 h,用無(wú)血清的 RMPI 1640培基洗滌 3次后,顯微鏡下計(jì)數(shù),以 25 Gy放射當(dāng)量輻照細(xì)胞,作為體外刺激 T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞 (Antigen Presenting Cell,APC)備用。

1.7 抗原肽預(yù)先免疫的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞懸液的制備

初次免疫,無(wú)菌條件下將 1 mg實(shí)驗(yàn)組多肽抗原 (P1、P2、P3以 1∶1∶1的比例混合)以及對(duì)照肽分別溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,與 0.5 mL弗氏完全佐劑 (CFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混勻。75%酒精棉球消毒 HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠尾根部,尾根部左右兩側(cè)皮下分別注入抗原肽與弗氏佐劑混勻物約 50μL。

加強(qiáng)免疫,無(wú)菌條件下將 1 mg實(shí)驗(yàn)組多肽抗原以及對(duì)照肽分別溶于 10μL DMSO中,再溶于 0.5 mL PBS中,與 0.5 mL弗氏不完全佐劑 (IFA;Sigma,St.Louis,MO)完全混勻。初次免疫后 10～14 d,實(shí)施再次免疫。用 75%酒精棉球消毒其尾根部,在其尾根部左右兩側(cè)皮下分別注入抗原肽與弗氏佐劑混勻物約 50μL。

再次免疫后 7～10 d后,將小鼠經(jīng)脫頸椎處死,浸入 75%酒精中。10 min后,在超凈臺(tái)內(nèi)小心取出已經(jīng)腫大的腹股溝淋巴結(jié) (左右各 1個(gè)),置于 RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。收集齊所有小鼠腹股溝淋巴結(jié)后,每組分別置于 150目篩網(wǎng)上,以 5 mL注射器活塞研磨,研磨過(guò)程中不時(shí)用培養(yǎng)液沖洗篩網(wǎng),獲得單細(xì)胞懸液。以 1640培養(yǎng)液,400 g,離心 10 min,調(diào)細(xì)胞濃度為 1×106/mL備用。

1.8 抗原肽特異性 CD8+CTL的制備

將輻照后的 DC與貼壁 4 h后的淋巴結(jié)細(xì)胞懸液中未貼壁細(xì)胞以 1∶10的比例混合均勻,RPMI 1640完全培養(yǎng)液,開(kāi)始第一輪體外活化。5 d后換液,另外添加 IL-2(R＆D,終濃度 10 ng/mL),5 d后再次加入新制備的輻照后的 DC,開(kāi)始第二輪的刺激。經(jīng)過(guò) 3～4輪的體外刺激,并進(jìn)一步使用紅細(xì)胞裂解,死細(xì)胞去除試劑盒 (Dead Cell Removal Kit,Miltenyi Biotec,Germany),免疫磁珠負(fù)性分選CD8+T淋巴細(xì)胞 (CD8+TCell Isolation Kit,Miltenyi Biotec,Germany)得到純度較高的抗原肽特異性T淋巴細(xì)胞群 (另文發(fā)表)。

1.9 抗原肽特異性 CD8+CTL的 Tetramer流式細(xì)胞儀檢測(cè)

由荷蘭 Sanquin公司設(shè)計(jì)并合成 P1,P2,P3表位特異性 PE-Tetramer。取 6組分選后的 CD8+CTL,每組 2 mL,細(xì)胞濃度為 1×106/mL。取其中3組作為實(shí)驗(yàn)組,300 g,10 min離心后,吸棄上清,加入 40μL含 0.5%胎牛血清的 PBS,分別與10 μL的 P1-PE-Tetramer、P2-PE-Tetramer、P3-PETetramer混合,在 18～25℃條件下孵育 20 min;再分別與 APC anti-mouse CD8a(clone 53-6.7,Biolegend)2μL混合,4℃條件下孵育 30 min。3個(gè)對(duì)照組的染色抗體為 APC-Rat IgG2a,κIsotype Ctrl(clone RTK2758,Biolegend)2μL混合,4℃條件下孵育 30 min。PBS洗滌 3遍后,300 g,10 min離心,各組皆調(diào)濃度 1×106/mL,4℃保存,流式細(xì)胞儀檢測(cè)表型。

1.1 0 ELISPOT技術(shù)檢測(cè) CD8+CTL對(duì)特異性抗原刺激的反應(yīng)

所用試劑盒為Mouse IFN-γPrecoated ELISPOT kit(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)分組:APHA(sigma)陽(yáng)性對(duì)照組 +抗原肽特異性 CD8+CTL;B-抗原肽特異性 CD8+CTL;C-抗原肽負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞 +抗原肽特異性 CD8+CTL;D-對(duì)照肽負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞 +對(duì)照肽特異性 CD8+CTL;E-空白樹(shù)突狀細(xì)胞 +抗原肽特異性 CD8+CTL;F-空白樹(shù)突狀細(xì)胞 +對(duì)照肽特異性 CD8+CTL。具體操作見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 煙曲霉特異性抗原肽的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

在前期工作基礎(chǔ)上,我們使用由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心和德國(guó) Tubingen大學(xué)免疫系提供的生物信息學(xué)軟件掃描了位于煙曲霉細(xì)胞壁的抗原 Asp f16的全部 427個(gè)氨基酸序列[16]。鑒于國(guó)人最常見(jiàn)的 HLA位點(diǎn)是 HLA-A＊0201,我們選擇了該位點(diǎn)作為靶點(diǎn),并根據(jù)與 HLA分子穩(wěn)定性半衰期評(píng)分篩選并合成了 3條 9肽 (見(jiàn)表 1)。

2.2 體外培養(yǎng)小鼠骨髓造血干細(xì)胞來(lái)源的 DC及成熟 DC的表型鑒定

貼壁細(xì)胞在 mGM-CSF和 mIL-4培養(yǎng) 3 d時(shí),DC數(shù)量明顯增多,并有部分細(xì)胞懸浮,懸浮細(xì)胞有小的突起,出現(xiàn)大量半貼壁半懸浮的集落,集落表面的細(xì)胞有小的突起。第 4天,細(xì)胞增加更多,表面出現(xiàn)長(zhǎng)長(zhǎng)的樹(shù)枝狀突起。第 5天加入 TNF-α促使其成熟,至第 7天培養(yǎng)液中的大部分細(xì)胞已經(jīng)基本成熟,成較大的圓球形,表面有刺狀突起。培養(yǎng) 7 d的 DC,經(jīng)過(guò) 4種熒光抗體的標(biāo)記之后,顯示表達(dá)各種標(biāo)記抗體對(duì)應(yīng)的表面分子細(xì)胞數(shù)量百分比為:MHCⅡ-32.80%,CD80-52.39%,CD11c-55.38%,CD86-43.15%,表明所培養(yǎng)的樹(shù)突細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)程度的表型成熟。證實(shí)我們建立了穩(wěn)定的樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)成熟體系 (見(jiàn)圖 1)。

2.3 體外檢測(cè)抗原肽特異性 CTL的研究

預(yù)先皮下免疫獲得的引流淋巴結(jié)來(lái)源的 T細(xì)胞,經(jīng)過(guò) APC(負(fù)載抗原肽的樹(shù)突狀細(xì)胞)體外 2～4輪的刺激:第一輪前 5 d不加細(xì)胞因子 IL-2,目的是確保非特異性 T細(xì)胞死亡,以提高抗原特異性T細(xì)胞的純度;從第二輪開(kāi)始,細(xì)胞快速增殖,每隔1 d就要傳代;至第 3～4周特異性 CTL達(dá)到一定純度,經(jīng)過(guò)溶紅、去死、CD8陰選一系列處理之后,以 PE標(biāo)記的 P1、P2、P3特異性四聚體和 APC標(biāo)記的 CD8a熒光抗體共同染色。結(jié)果表明,CD8分子陽(yáng)性率為 90%以上。Tetramer實(shí)驗(yàn)顯示 P1、P2、P3的陽(yáng)性表達(dá)率即 3種 9肽特異性 CTL所占的比率分別為 10.66%,7.29%,5.03%(見(jiàn)圖 4)。因此,我們應(yīng)用 Tetramer實(shí)驗(yàn)證實(shí)了煙曲霉 3種抗原肽與 HLA-A＊0201分子的親和力 (見(jiàn)圖 2)。

2.4 ELISPOT煙曲霉特異性抗原肽體外活化 T細(xì)胞的研究

我們應(yīng)用 ELISPOT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的煙曲霉抗原多肽體外可以活化 CTL并產(chǎn)生細(xì)胞因子 IFN-γ?？乖岢始?xì)胞與 CD8+CTL經(jīng)過(guò) 20 h的作用,不同分組孔內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞因子 IFN-γ的 T細(xì)胞的數(shù)量不同:①陽(yáng)性對(duì)照組在低濃度絲裂原PHA的刺激下,一部分煙曲霉肽特異性 CTL分泌IFN-γ。②無(wú) APC的刺激時(shí),煙曲霉肽特異性 CTL幾乎不分泌 IFN-γ,細(xì)胞數(shù)僅為 (4.0±3.6)spots/well。③在特異性 APC的刺激下,數(shù)量很多的煙曲霉肽特異性 CTL分泌 IFN-γ,高達(dá) (266.0±39.2)spots/well。④在對(duì)照肽負(fù)載 DC刺激下,數(shù)量很多的對(duì)照肽特異性 CTL分泌 IFN-γ。⑤非抗原負(fù)載DC刺激下,很少數(shù)目的煙曲霉肽特異性 CTL分泌IFN-γ。⑥非抗原負(fù)載 DC刺激下,很少數(shù)目的對(duì)照肽特異性 CTL分泌 IFN-γ。具體數(shù)值見(jiàn)圖 2。這些結(jié)果表明煙曲霉抗原肽和對(duì)照肽體外可以活化相應(yīng)的 CD8+CTL并產(chǎn)生 IFN-γ(見(jiàn)圖 3)。

3 討 論

IA是一種主要由煙曲霉引起,通常侵犯免疫力受損人群的破壞性和致死率極高的惡性感染,病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸取決于煙曲霉的侵襲力和宿主的抗真菌免疫能力之間的平衡[7,8]。通常情況下,人們每天都會(huì)吸入大量煙曲霉孢子,對(duì)于免疫力正常的宿主,以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為代表的固有性免疫與以 T淋巴細(xì)胞為主導(dǎo)的特異性免疫可以迅速將侵入體內(nèi)的煙曲霉完全清除,而不發(fā)病[8]。然而對(duì)于免疫受損患者,不能及時(shí)徹底清除煙曲霉這種生長(zhǎng)繁殖非常迅速的病原真菌,一旦感染,后果十分嚴(yán)重。

圖 1 小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞體外表型。小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞在添加了細(xì)胞因子 rmGM-CSF(20 ng/mL)和 rmIL-4(10 ng/mL)的R10培養(yǎng)基中孵育。第 5天,加入 rmTNF-alpha(10 ng/mL),第 7天,收獲樹(shù)突狀細(xì)胞,染色,流式細(xì)胞儀分析 圖 2 Tetramer實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Asp f16多肽特異性 T細(xì)胞。Asp f16多肽特異性CD8+T細(xì)胞 (1×106/mL)與 Asp f16特異性 tetramer,APC熒光標(biāo)記的抗鼠 CD8a單克隆抗體 4℃染色 30 min,然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析 圖 3 ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè) CD8+CTL特異性 IFN-γ的釋放。5×103樹(shù)突狀細(xì)胞與 25μg/mL Asp f16多肽混合物或者對(duì)照肽37℃孵育 2 h,然后與 5×104同源的CTL共孵育 20 h。使用PHA作為陽(yáng)性對(duì)照,每一個(gè)柱狀圖代表 3次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)值 ±SD。A-PHA刺激 Asp f16多肽特異性 CTL;B-Asp f16多肽特異性 CTL;C-Asp f16多肽負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞活化Asp f16多肽特異性CTL;D-對(duì)照肽負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞活化對(duì)照肽特異性CTL;E-無(wú)多肽負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞活化 Asp f16多肽特異性 CTL;F-無(wú)多肽負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞活化對(duì)照肽特異性CTLFig.1 Phenotypes of the in vitro generated murine dendritic cells derived from bone marrow.The DCswerecultured in the R10medium supplemented with rmGM-CSF(20 ng/mL)and rmIL-4(10 ng/mL).On day 5,rmTNF-alpha(10 ng/mL)was added in and the DCs were harvested and analyzed by flow cytometry on day 7 Fig.2 Tetramerbased detection of Asp f16 peptides-specific T cells.Asp f16 peptidespecific CD8+Tcells(1×106/mL)were stained with Asp f16-specific tetramers and APC-labeled anti-mouse CD8amonoclonal antibody at 4℃for 30 minites.The cells were then analyzed by flow cytometry Fig.3 Specific IFN-γrelease by in vitro-stimulated CD8+CTL measured by ELISPOT.Dendritic cells(5×103)were incubated with 25μg/mL of Asp f16 peptides mixtures or control peptide at 37℃for 2 hours and then co-cultured with 5×104 autologous CTLs in each well for 20 hours.PHA was used as positive control in all assays.Each value was represented as the mean±SD.A-PHA stimulated Asp f16 peptides specific CTLs;B-Asp f16 peptides specific CTLs alone;C-Asp f16 peptides loaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;D-Control peptide loaded DCs plus control peptide specific CTLs;E-Peptide unloaded DCs plus Asp f16 peptides specific CTLs;F-Peptide unloaded DCs plus control peptide specific T cells

流行病學(xué)研究表明 IA的發(fā)病人群構(gòu)成主要是造血干細(xì)胞移植患者、移植物抗宿主病患者、實(shí)體器官移植患者、腫瘤化療患者、HIV感染者等,這類(lèi)患者常常伴有嚴(yán)重的 T細(xì)胞免疫功能缺陷[1-5]。國(guó)內(nèi)外大量研究也表明 T細(xì)胞免疫在宿主清除煙曲霉感染中具有重要作用,研究者發(fā)現(xiàn)通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移煙曲霉培養(yǎng)粗提物抗原活化的小鼠 T細(xì)胞,能顯著增加后繼靜脈內(nèi)給予煙曲霉孢子的小鼠的存活率,從而證實(shí)了煙曲霉特異性 T細(xì)胞具有免疫治療作用[7,9-11]。因此,體外建立供體來(lái)源的煙曲霉特異性 T細(xì)胞克隆,在受體對(duì) IA易感時(shí)期 (例如:HSCT后早期,預(yù)防及治療 GVHD時(shí)),過(guò)繼轉(zhuǎn)移給受體,可以建立受體針對(duì)煙曲霉的特異性免疫反應(yīng)能力,從而保護(hù)受體免于發(fā)病或者增強(qiáng)其對(duì)治療的反應(yīng)性,免疫治療 IA具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景[12-14]。

但是,我們的前期工作結(jié)果顯示煙曲霉孢子的免疫原性較差,獲得的煙曲霉特異性分泌 IFN-γ的Th1細(xì)胞絕對(duì)值較低,與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果較一致[7,17]。目前的多數(shù)研究使用煙曲霉孢子、菌絲或者煙曲霉胞壁蛋白粗提物作為抗原,除了含有相關(guān)的特異性抗原外,還包括大量的非相關(guān)抗原成分,包括糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸甚至毒素[6,10-14,17]。它的主要缺點(diǎn)是抗原為混合物,純度低,且免疫原性不強(qiáng),不適合臨床應(yīng)用,甚至危及患者生命。因此,篩選和鑒定合適的煙曲霉抗原表位,成為提高過(guò)繼免疫治療 IA療效的關(guān)鍵問(wèn)題。

研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉重組過(guò)敏原 Asp f16(編碼基因crf1,GenBank entry AJ223327,Genomic locus Afu1g16190)可以引起顯著的 T細(xì)胞免疫應(yīng)答[18,19]。研究者使用 Asp f16抗原作為疫苗免疫小鼠,誘導(dǎo)保護(hù)性 T細(xì)胞應(yīng)答,增加了小鼠對(duì)抗肺煙曲霉感染的能力和存活時(shí)間[20]。據(jù)此,本研究根據(jù)煙曲霉抗原 Asp f16的氨基酸全序列信息,利用生物信息學(xué)軟件,以我國(guó)漢族人群常見(jiàn)的限制性位點(diǎn) HLA-A＊0201為靶點(diǎn)篩選合成 3條 HLA-I限制的 9肽,誘導(dǎo)產(chǎn)生煙曲霉特異性的 CTL,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定[16]。篩選和鑒定已知氨基酸序列抗原的 T細(xì)胞表位通常采用全長(zhǎng)序列范圍內(nèi)的基序預(yù)測(cè)法和肽段重疊法,本研究采用基序預(yù)測(cè)法通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)煙曲霉抗原表位,與肽段重疊法相比較,可節(jié)省大量人力物力,可以作為一個(gè)快速高效篩選合適抗原肽的工作平臺(tái)。

本研究建立了轉(zhuǎn)人基因 HLA-A＊0201小鼠 DC培養(yǎng),誘導(dǎo)成熟,抗原遞呈,以及 CTL體外擴(kuò)增體系,為進(jìn)一步在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)模擬了人體發(fā)病和免疫應(yīng)答反應(yīng)的過(guò)程,評(píng)估多肽特異性 CTL在免疫治療 IA的作用和 CTL殺傷煙曲霉的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。選擇轉(zhuǎn)人基因 HLA-A＊0201小鼠作為研究對(duì)象,將合成的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的煙曲霉Asp f16抗原肽預(yù)先皮下免疫 HLA-A＊0201轉(zhuǎn)基因小鼠,可以模擬體內(nèi)免疫環(huán)境,獲得的引流淋巴結(jié)來(lái)源的 T細(xì)胞,使免疫反應(yīng)最大化和最優(yōu)化[15]。通過(guò)已有的技術(shù)平臺(tái),體外負(fù)載成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞,由其加工、遞呈給 T細(xì)胞,在體外制備煙曲霉多肽特異性 CTL[7]。MHC-四聚體試驗(yàn)證實(shí)了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的抗原表位與 HLA-A＊0201分子具有很強(qiáng)的的結(jié)合能力。ELISPOT試驗(yàn)證實(shí)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的煙曲霉 Asp f16的抗原肽可以活化 T細(xì)胞,并釋放大量 IFN-γ。因此,本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的 3個(gè)抗原肽,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定為煙曲霉抗原Asp f16的 HLA-A＊0201限制性 CD8+CTL的抗原表位,可作為今后設(shè)計(jì)抗煙曲霉多表位肽疫苗的備選肽,并為進(jìn)一步研究 CTL殺傷煙曲霉機(jī)制和免疫治療 IA提供參考。

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