“七皮飲”對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控

高 琴，徐麗敏

（天津市長征醫(yī)院，天津 300120）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，目前治療方法雖多，但總體效果欠佳。我科自擬“七皮飲”治療銀屑病，自1999年應(yīng)用至今，臨床觀察療效顯著。本研究觀察“七皮飲”對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，以探討其作用機(jī)制，為其治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：永生化人類角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT，由中國醫(yī)科大學(xué)提供。主要試劑：MTT（SIGMA 公司）；碘化丙啶（PI）染料（Sigma公司）；RNA酶A（Sigma公司）。主要儀器：流式細(xì)胞儀（FACSCalibur型美國BD公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥的制備 研磨單味及復(fù)方中藥為粉末狀，三蒸水冷浸泡2周后，汲出藥液，過濾，-80℃冷凍，用Ct60冷凍干燥箱冷提為粉劑，-20℃保存。待用時(shí)再用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整濃度，過0.22μm濾膜除菌。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率（relative growth rate,RGR） 細(xì)胞種板，貼壁后加入不同濃度的藥物，終濃度分別為 5、10、15、20、25mg/mL，培養(yǎng) 48～72 h，進(jìn)行MTT檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。具體方法如下：分別在每孔加入5mg/mL的MTT100μL，孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150 μL，室溫震蕩10min，以490nm波長檢測(cè)各孔的光吸收值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3 細(xì)胞接種 取對(duì)數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞，用0.25%胰酶/EDTA消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)成3×105個(gè)/mL接種于12孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液1mL，以不加中藥組為對(duì)照。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，期間隨時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長情況。待細(xì)胞生長接近融合狀態(tài)時(shí)，藥物組每孔加入中藥500μL（終濃度分別為25、12.5、6.25mg/mL），對(duì)照組培養(yǎng)孔加入500μLDMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)照組及各濃度組各接種3個(gè)培養(yǎng)孔，培養(yǎng)時(shí)間分別為 24h、48h、72h。

1.2.4 PI染色法 分別于24、48、72 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入0.25%胰酶/EDTA消化收集細(xì)胞懸液，800r/min離心8min，PBS洗滌2次，加入冰預(yù)冷的70%乙醇2mL破膜固定，4℃保存1～2h；800r/min離心8min，棄去固定液，PBS重懸5min；400目篩網(wǎng)過濾1次，800r/min離心8min，棄去PBS；加入1mL已配好的碘化丙啶 (PI)染液，4℃避光保存30min，30min內(nèi)上機(jī)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定 PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光，可分析前散射光和對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖及PI熒光的直方圖。

應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量，經(jīng)488nm激光激發(fā)，得出DNA示意圖，圖中第一個(gè)峰（G1）是DNA含量為2N的細(xì)胞峰，第二個(gè)峰（G2）是DNA含量為4N的細(xì)胞峰，兩峰之間是DNA含量為2N～4N的處于活躍的DNA合成期（S期）的細(xì)胞。依CellQuest軟件,每個(gè)樣本獲取10 000個(gè)細(xì)胞，用廠家提供的Multicycle軟件，對(duì)上述所測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，計(jì)算機(jī)可自動(dòng)計(jì)算出G1%、S%、G2%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SAS8.1統(tǒng)計(jì)分析軟件完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，采用析因設(shè)計(jì)的兩因素多水平方差分析。

2 結(jié)果

2.1“七皮飲”及七味單藥對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖密度和形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下可見，HaCaT細(xì)胞藥物組和對(duì)照組細(xì)胞增殖密度相比較，用“七皮飲”處理48h后6.25mg/mL組細(xì)胞密度有所減少，有部分細(xì)胞懸?。?2.5mg/mL組細(xì)胞生長停滯，密度減小，懸浮細(xì)胞增多；25mg/mL組可見大部分細(xì)胞已懸浮。

MTT法測(cè)定八種藥物不同濃度下的RGR，結(jié)果表明地骨皮對(duì)HaCaT細(xì)胞具有增殖作用，其它七種藥物則對(duì)HaCaT細(xì)胞具有抑制作用，其中“七皮飲”對(duì)細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，且均存在劑量依賴關(guān)系，見表1。

表1 八種藥物不同濃度RGR（±s） %

表1 八種藥物不同濃度RGR（±s） %

注：對(duì)照組為100%。

5mg/mL 116.13±29.80 96.41±12.09 123.11±20.90 88.79±21.42 92.57±11.13 89.42±11.74 94.79±8.03 88.17±14.23 10mg/mL 116.99±31.48 72.07±15.85 108.62±15.53 55.16±27.49 75.569±10.79 69.61±15.98 92.26±8.87 53.67±23.10 15mg/mL 127.31±32.13 60.30±13.91 88.13±11.93 50.20±27.72 72.24±9.17 46.51±18.13 86.33±10.20 41.49±22.2藥物地骨皮桑白皮牡丹皮大腹皮合歡皮白鮮皮陳皮七皮飲20mg/mL 146.64±20.24 49.84±14.42 61.72±30.30 43.60±27.88 60.33±12.04 30.04±20.85 76.99±9.67 25.94±9.88 25mg/mL 146.66±20.76 43.74±22.79 48.65±29.88 43.80±26.84 27.89±9.82 20.84±14.86 75.57±13.00 13.01±15.03

2.2“七皮飲”對(duì)HaCaT細(xì)胞周期的結(jié)果

2.2.1 G0/G1期 不同濃度不同作用時(shí)間G0/G1期細(xì)胞比例，見表2。對(duì)不同濃度不同作用時(shí)間G0/G1期細(xì)胞比例（%）進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示：不同時(shí)間組間G0/G1期細(xì)胞比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；不同濃度組間G0/G1期細(xì)胞比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)時(shí)間和濃度之間存在交互作用（P=0.01）。

表2 不同濃度各時(shí)間G0/G1期細(xì)胞比例（±s） %

表2 不同濃度各時(shí)間G0/G1期細(xì)胞比例（±s） %

濃度（mg/mL）0 65.48±2.86 67.94±2.15 77.90±2.77 6.25 73.92±3.75 82.23±3.04 85.15±3.19 12.5 85.92±2.88 85.97±2.99 89.97±2.70 25 87.87±2.77 87.93±3.49 92.17±4.02時(shí)間（h）24 48 72

時(shí)間與濃度的交互作用：各濃度組隨時(shí)間推移G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，各時(shí)間段隨著濃度的增加G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加。即G0/G1期細(xì)胞比例濃度和時(shí)間具有明顯的計(jì)量反應(yīng)關(guān)系。

2.2.2 G2/M期 不同濃度不同作用時(shí)間G2/M期細(xì)胞比例，見表3。對(duì)不同濃度不同作用時(shí)間G2/M期細(xì)胞比例（%）進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示：不同時(shí)間>G2/M期細(xì)胞比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；不同濃度組間G2/M期細(xì)胞比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；同時(shí)時(shí)間和濃度之間存在交互作用（P<0.01）。

表3 不同濃度各時(shí)間G2/M期細(xì)胞比例（±s） %

表3 不同濃度各時(shí)間G2/M期細(xì)胞比例（±s） %

濃度（mg/mL）12.5 5.06±0.19 4.09±0.22 4.06±0.17 25 4.27±0.16 5.52±0.20 4.36±0.21時(shí)間（h）24 48 72 0 4.72±0.17 3.79±0.15 4.57±0.17 6.25 4.76±0.15 3.37±0.17 4.67±0.20

時(shí)間與濃度的交互作用：25mg/mL濃度組隨時(shí)間推移G2/M期細(xì)胞比例先增加后下降，其它濃度組隨時(shí)間推移G2/M期細(xì)胞比例先下降后增加，其中25mg/mL濃度組在48hG2/M期細(xì)胞比例最高。

2.2.3 S期 不同濃度不同作用時(shí)間S期細(xì)胞比例，見表4。對(duì)不同濃度不同作用時(shí)間組S期細(xì)胞比例（%）進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示不同作用時(shí)間組間S期細(xì)胞比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），不同濃度組間S期細(xì)胞比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)時(shí)間和濃度之間存在交互作用（P<0.01）。

表4 不同濃度不同時(shí)間S期細(xì)胞比例（±s） %

表4 不同濃度不同時(shí)間S期細(xì)胞比例（±s） %

濃度（mg/mL）時(shí)間（h）24 48 72 0 35.83±1.30 28.99±1.16 24.59±1.32 12.5 12.26±0.46 26.33±1.42 6.06±0.25 25 6.43±0.25 23.40±0.86 3.24±0.15 6.25 27.27±0.86 27.92±1.39 7.74±0.33

時(shí)間與濃度的交互作用：對(duì)照組隨著時(shí)間的推移，S期細(xì)胞比例逐漸下降，其它各個(gè)濃度組隨著時(shí)間的推移，S期細(xì)胞比例先增加后下降。各個(gè)時(shí)間段，隨著濃度的增加S期細(xì)胞比例逐漸下降，其中24h段下降最快，48h段下降最緩。對(duì)照組24h S期細(xì)胞比例最高，25mg/mL濃度組72h S期細(xì)胞比例最低。

“七皮飲”抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，主要表現(xiàn)為使角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G1期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著藥物濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加。另外，隨著藥物濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長，S期細(xì)胞比例明顯下降。

3 討論

銀屑病主要與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化異常有關(guān)，而后者又與角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期的改變相聯(lián)系。

在真核細(xì)胞周期進(jìn)程中存在著一些關(guān)鍵的過渡點(diǎn)，當(dāng)其受到外界壓力時(shí)會(huì)限制細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變，被稱為細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)[1]。檢測(cè)點(diǎn)是作用于細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換過程的關(guān)鍵調(diào)控通路，一般認(rèn)為細(xì)胞周期中存在兩個(gè)主要限制點(diǎn)，即G1/S限制點(diǎn)和G2/M限制點(diǎn)。

目前普遍認(rèn)為角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期G1/S調(diào)控點(diǎn)異常是角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生發(fā)生的重要機(jī)制。細(xì)胞在該檢測(cè)點(diǎn)對(duì)各類生長因子、分裂原以及DNA損傷等復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)的刺激下產(chǎn)生級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)，決定細(xì)胞是否進(jìn)行分裂、發(fā)生凋亡或是進(jìn)入G0期[2]。任何一個(gè)可以引起G1/S調(diào)控點(diǎn)異常的因素都可以影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。在角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生的發(fā)生發(fā)展過程中多能觀察CyclinD或 CDK4的過表達(dá)和 CKI的失活[3-6]。CDK4、p21CIP1、p27KIP1 為三種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，它們均通過作用于Gl期而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化[7-9]。

有研究表明，銀屑病皮損中CyclinD和p21CIP1的含量比正常皮膚增高，而p27KIP1的含量卻比正常降低[10-12]。p27KIP1在銀屑病中降低可能使其抑制CDK活性的作用減弱從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖。Baran等研究銀屑病患者皮損中p53的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，p53陽性細(xì)胞位于銀屑病患者皮損區(qū)的表皮全層，而正常皮膚和銀屑病患者無皮損區(qū)p53只在表皮基底層表達(dá)，結(jié)果表明p53可能是銀屑病形成的一個(gè)重要因素[13]。

“七皮飲”由地骨皮、桑白皮、牡丹皮、大腹皮、合歡皮、白鮮皮、陳皮等藥組成，具有清熱涼血，活血化瘀，理氣安神的功效。根據(jù)銀屑病中醫(yī)病因病機(jī)，本方君藥桑白皮、地骨皮，一氣一血，氣血兩清，清熱涼血而不傷陰，護(hù)陰液而不致戀邪；臣藥牡丹皮涼血降火，善透泄血中伏熱；合歡皮解郁安神，活血消腫；佐藥陳皮、大腹皮、白鮮皮理氣健脾，行氣寬中，而消氣滯濕阻。

本研究發(fā)現(xiàn)“七皮飲”使角質(zhì)形成細(xì)胞阻滯于G1期。G1期的阻滯與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，它是DNA修復(fù)期，使損傷的DNA在染色體分離前得到修復(fù)，不能修復(fù)者則退出增殖周期進(jìn)入凋亡階段。因此“七皮飲”可通過阻斷細(xì)胞周期抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，這可能是其治療銀屑病的機(jī)制。但它究竟是通過何種途徑引起細(xì)胞周期阻滯于G1期還有待于更深入的研究。

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