少腹逐瘀湯中7種有效成分的HPLC-PDA分析與評價

崔文霞， 束 艷， 宿樹蘭*， 鄔 璟， 段金廒*， 唐于平

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑研究重點實驗室，江蘇 南京 210046)

少腹逐瘀湯(Shaofu Zhuyu Decoction，SFZYD)源于清代王清任的《醫(yī)林改錯》，由當(dāng)歸、赤芍、川芎、五靈脂、蒲黃、小茴香、干姜、肉桂、延胡索、沒藥十味中藥組成。方中以當(dāng)歸、赤芍、川芎為君藥，具有活血化瘀、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效;五靈脂、蒲黃、延胡索、沒藥為輔藥，以通利血脈、祛瘀止痛;小茴香、干姜、肉桂為佐藥，溫經(jīng)散寒、理氣止痛，并引諸藥直達少腹，全方組合具有溫經(jīng)散寒、活血化瘀、消腫止痛之功效［1］。現(xiàn)代研究表明，少腹逐瘀湯具有解痙、鎮(zhèn)痛、抗炎、改善血液循環(huán)的藥理作用［1-3］，但少腹逐瘀湯效應(yīng)物質(zhì)研究相對較少。

本課題組在前期研究工作中采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)分析鑒定了其中11個主要的化學(xué)成分［1］;采用高效液相色譜法(HPLC)分析評價了其有效部位中的7個化學(xué)成分［4］。本實驗在效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上［5-8］，采用HPLC法對其中多種效應(yīng)成分，包括咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、香草酸、芍藥苷、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷進行定量分析，并考察了少腹逐瘀湯水煎液和醇沉上清液中主要活性成分的含量差異，比較不同前處理方法對有效成分測定的影響，最終建立簡便可行的同時測定少腹逐瘀湯中多種類型有效成分的HPLC分析方法，為少腹逐瘀湯的復(fù)雜效應(yīng)物質(zhì)及其作用機理的揭示提供了一定參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996 PDA檢測器，Empower工作站;Startorius電子天平，型號:BT1250;KQ-250E型超聲波清洗器(工作頻率40 KHz);Anke(TDL240B)離心機(上海安壽科學(xué)儀器廠);EPED超純水機(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)。

對照品沒食子酸(批號:110831-200302)，香草酸(批號:110776-200402)，咖啡酸(批號:110885-200102)，阿魏酸(批號:110773-200611)，芍藥苷(批號:110736-200934)，異鼠李素-3-O-新橙皮苷(批號:111571-200402)，香蒲新苷(批號:111573-200503)上述對照品購于中國藥品生物制品檢定所。化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 各對照品化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of reference substances

甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)及乙腈(美國TEDIA公司)均為色譜純，乙酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)為分析純，超純水為實驗室自制。

組方藥材均購于南京市藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》(2010年版)項下標準。

2 色譜條件

色譜柱:Dikma Diamonsil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相 乙腈(A)-0.05%乙酸溶液(B)，梯度洗脫(0～8 min:A 0% ～5%;8～10 min:A 5%;10～30 min:A 10%～16%;30～45 min:A16%～24%;45～86 min:A 24% ～44%);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進樣量10 μL。沒食子酸，香草酸測定波長為270 nm;咖啡酸，阿魏酸測定波長為320 nm;芍藥苷測定波長為230 nm;香蒲新苷，異鼠李素-3-O-新橙皮苷測定波長350 nm。在上述色譜條件下，對照品色譜圖和樣品色譜圖見圖2～6。

圖2 7種混合對照品溶液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 7 reference substances

圖3 50%甲醇處理少腹逐瘀湯的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of SFZYD dealt with 50%methanol

3 溶液制備

3.1 供試品溶液的制備 稱取少腹逐瘀湯組方藥材粗粉465.0 g，按照當(dāng)歸∶川芎∶赤芍∶肉桂∶小茴香∶五靈脂∶沒藥∶蒲黃∶延胡索∶干姜(3∶1∶2∶1∶0.5∶2∶1∶3∶1∶1)比例配比，水煎煮提取2次，第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1.5 h，合并兩次煎出液，濃縮至一定體積，取適量水煎液于60℃減壓濃縮干燥得水煎液浸膏(SFZYD);另取一定體積水煎液用95%乙醇調(diào)至含醇量為80%，放置24 h，過濾沉淀，取上清液于60℃減壓濃縮干燥得醇沉浸膏(SFA)。

圖4 無水甲醇處理少腹逐瘀湯的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of SFZYD dealt with methanol

圖5 50%甲醇處理少腹逐瘀湯醇沉上清液的HPLC圖Fig.5 HPLC chromatograms of SFA dealt with 50%methanol

圖6 無水甲醇處理少腹逐瘀湯醇沉上清液的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatograms of SFA dealt with methanol

精密稱取0.24 g水煎液浸膏粉末和0.16 g醇沉浸膏粉末(過三號篩)各2份，置具塞錐形瓶中，分別加入10 mL無水甲醇和50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，分別用溶劑補足減失質(zhì)量，3 000 r/min離心10 min后，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

3.2 混合對照品溶液的制備 取沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍藥苷、香草酸、香蒲新苷各對照品適量，精密稱定，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為 520、125、270、65、2 735、29、75 μg/mL的混合對照品貯備液。

4 方法學(xué)考察

4.1 線性范圍的考察 將3.2項下配制的混合對照品溶液分別進樣 2、5、10、15、20 μL，在上述色譜條件下進樣分析測定。以進樣量(μg)為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程(結(jié)果見表1)，采用外標法計算樣品中各成分量。

4.2 精密度實驗 取3.2項下的混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算色譜峰面積的RSD值，結(jié)果見表2。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n=5)Tab.1 Results of linear relationship(n=5)

表2 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2 Results of method validation

4.3 重復(fù)性實驗 精密稱取0.24 g水煎液浸膏粉末6份，用無水甲醇按3.1項方法制備供試品溶液，進行定量測定，7個成分質(zhì)量分數(shù)的RSD值結(jié)果見表2。

4.4 穩(wěn)定性實驗 取無水甲醇處理水煎液浸膏供試品溶液，分別于配制后 0、2、4、8、12 h 進行測定，計算各色譜峰面積的RSD值，結(jié)果見表2。

4.5 加樣回收率 精密稱取0.24 g水煎液浸膏粉末6份，各加入1 mL混合對照品溶液，用無水甲醇按3.1項下方法制備所需供試品溶液，測定，計算，結(jié)果見表2。

5 樣品測定

取按3.1項下方法處理的供試品溶液各3份，進樣10 μL，在上述色譜條件下測定，按外標法計算質(zhì)量分數(shù)。色譜圖見圖2～6，結(jié)果見表3。

表3 不同樣品中7個成分測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of the seven compounds in different samples(n=3)

6 討論

6.1 樣品處理方法的優(yōu)化 本研究曾采用固相萃取柱進行處理，此法處理后樣品有效成分損失較多，故選擇無水甲醇和50%甲醇作為樣品預(yù)處理方法，考察了不同處理方法對水煎液浸膏及醇沉浸膏中有效成分量的影響，結(jié)果表明:無水甲醇處理過的樣品溶液中雜質(zhì)峰干擾較小，有效成分量比50%甲醇處理過的稍高;醇沉浸膏中有效成分量較水煎液浸膏中的量高。

6.2 檢測波長的選擇 本實驗選擇的芍藥苷、咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、香草酸、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷指標成分為少腹逐瘀湯中主要活性物質(zhì)，但由于7個成分光譜差異較大，無法采用單一波長同時定量，故本實驗采用多波長高效液相色譜法［9］，參考文獻報道［7，10］，結(jié)合 7 種化合物的最大吸收波長和整體色譜圖的特征，本方法選擇了4個檢測波長，分別為320 nm，270 nm，350 nm，230 nm，進行定量測定，方法較為客觀準確，簡便易操作，為方劑復(fù)雜效應(yīng)成分的研究提供了一定的依據(jù)和參考。

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