水飛薊賓乳脂體注射劑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)

陳洪軒， 周曉丹， 陳志鵬

(1.黃河科技學(xué)院，河南鄭州 450000;2.河南大學(xué)藥物研究所，河南開封 475004;3.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州 730000;4.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

水飛薊賓(silibinin or silybin，SIL)是菊科植物水飛薊Silybam marianum(L.)Gaertn果實(shí)中提取的黃酮木脂類化合物的最主要成分［1］，水飛薊賓能夠穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，保護(hù)肝細(xì)胞的酶系統(tǒng)，清除肝細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，從而提高肝臟的解毒能力，避免肝細(xì)胞在長(zhǎng)期接觸毒物、服用肝毒性藥物、吸煙、飲酒等情況下受到的損傷，是療效確切的肝損傷修復(fù)藥。研究表明，水飛薊賓還具有良好的治療高脂血癥、消除自由基、抗肝脂質(zhì)過氧化、抗缺血再灌注損傷作用。臨床上用于治療急慢性肝炎、肝硬化及中毒性肝損傷［2-4］。由于水飛薊賓難溶于水，口服吸收差，嚴(yán)重削弱了水飛薊口服制劑的藥效。將其制成水溶性的葡甲胺鹽［5］、磷脂復(fù)合物［6］、固體分散體［7］，可以提高生物利用度。也有科研工作者將其制成水飛薊賓葡甲氨鹽注射劑，但其水溶液不穩(wěn)定，極易發(fā)生降解，制備成凍干粉針雖然可以解決其放置穩(wěn)定性問題，但是水飛薊賓葡甲氨鹽水溶液的pH值在11左右，注射時(shí)局部刺激性較大［8］。乳脂體(emulsome)是1994年P(guān)harmos公司發(fā)明的新技術(shù)，是新一代的載體系統(tǒng)，中心由甘油三酯組成脂肪核，外周具有一層或多層磷脂層。由于具有脂肪核，類似普通的o/w乳劑，外周又被磷脂層穩(wěn)定，類似脂質(zhì)體。它兼具有脂質(zhì)體和乳劑的特點(diǎn)，可作為親脂性藥物和親水性藥物的載體。研究表明，乳脂體作為藥物載體，具有提高生物利用度、緩控釋作用［9］、靶向和降低毒性［10-11］、穩(wěn)定性高、促進(jìn)藥物溶出等作用。本研究將水飛薊賓制成乳脂體注射劑，以提高水飛薊賓的生物利用度，并使水飛薊賓具有一定的緩釋作用。本實(shí)驗(yàn)考察了水飛薊賓乳脂體注射劑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(SPD-6A紫外檢測(cè)器、LC-5A型高壓泵、7125進(jìn)樣閥20 μL樣品管，Japan);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Zetasizer 3000HS激光粒度分析儀(Malvern公司);LG16-W高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 藥品及試劑 SIL原料藥(盤錦格林恩生物資源開發(fā)有限公司，含量98%);SIL對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);Sephadex G-50(臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，純度＞92%);三月桂酸甘油酯(東京化成工業(yè)株式會(huì)社);膽固醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán));甲醇(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，色譜純);乙腈(上海陸都化學(xué)試劑廠，色譜純);肝素鈉(天津市生物化學(xué)制藥廠)。

1.3 動(dòng)物 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量280～300 g，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，為清潔級(jí)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 水飛薊賓乳脂體注射劑的制備［12］定量稱取大豆磷脂、三月桂酸甘油酯、膽固醇和SIL溶于適量三氯甲烷中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑至形成干膜。加入適量PBS振搖水合至形成均一的分散液。超聲使粒徑達(dá)到要求。

2.2 水飛薊賓乳脂體粒徑和Zeta電位的測(cè)定 取水飛薊賓乳脂體混懸液適量，用激光粒度分析儀測(cè)量樣品的平均粒徑和Zeta電位。

2.3 水飛薊賓乳脂體包封率的測(cè)定 采用葡聚糖凝膠(Sephadex G-50)柱層析法分離未包封藥物。精密吸取水飛薊賓乳脂體混懸液0.5 mL上柱分離，

Memu為乳脂體中所包封水飛薊賓的量，Mtol為乳脂體混懸液中所含的水飛薊賓的量。

2.4 藥動(dòng)學(xué)研究

法治是人類治國(guó)理政智慧的結(jié)晶，也是我國(guó)歷史經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)的科學(xué)總結(jié)。“楓橋經(jīng)驗(yàn)”發(fā)展，從社會(huì)改造和幫教到社會(huì)治安綜合治理，再到社會(huì)管理創(chuàng)新，走上法治化征途，既是必然的選擇，也是實(shí)踐的努力。法院作為“楓橋經(jīng)驗(yàn)”的踐行者和法治建設(shè)的生力軍，在其中發(fā)揮了應(yīng)有作用。

2.4.1 色譜條件［13］色譜柱:Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm，大連依利特);預(yù)柱:C18(20 mm×4.6 mm，5 μm)(天津特納科學(xué)儀器公司);流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸溶液(50∶50∶1)，用前分別經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾，超聲混勻備用;體積流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):288 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.4.2 血漿樣品的處理 精密移取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL的塑料離心管中，加入乙腈100 μL，渦旋30 s，15 000 r/min 離心5 min，取上清液進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取6.25 mg的SIL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為250 μg/mL的貯備液，分別移取此溶液適量置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成水飛薊賓質(zhì)量濃度分別為 2、5、10、20、50、125、250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密移取以上各標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL至98 μL的空白血漿中，再加入乙腈100 μL，按血漿樣品的處理方法操作，得到質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.25、2.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按血漿樣品的處理方法操作，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)作圖，得到線性回歸方程。

2.4.4 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 在空白大鼠血漿中加入SIL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其質(zhì)量濃度分別為0.05、0.20、1.25 μg/mL，按“血漿樣品的處理”操作，計(jì)算測(cè)得量，與實(shí)際加入量比較，計(jì)算回收率。分別在日內(nèi)進(jìn)樣5次;同時(shí)連續(xù)5日，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。

2.4.5 SIL乳脂體大鼠藥動(dòng)學(xué)研究 12只大鼠隨機(jī)分成兩組，每組6只，均按照3.8 mg/kg的劑量給藥，第1組尾靜脈注射SIL乳脂體，第2組尾靜脈注射SIL自配的溶液劑(精密稱取水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置10 mL量瓶中，再加入4 mL PEG400，水補(bǔ)至10 mL，0.22 μm 濾膜過濾即得制備成 0.5 mg/mL以PBS為洗脫液洗脫，分管接收洗脫液，含乳脂體的接收液合并后以甲醇破乳，稀釋至一定濃度后，測(cè)得乳脂體中所包封的水飛薊賓的量Memu，另吸取水飛薊賓乳脂體混懸液，測(cè)得水飛薊賓乳脂體混懸液中所含的水飛薊賓的量Mtol，按以下公式計(jì)算包封率:水飛薊賓溶液劑)，給藥后分別于 2、5、10、15、30、45、60、90、120、240 min 時(shí)間取點(diǎn)，按“血漿樣品處理”操作后進(jìn)樣測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SIL的血藥濃度，血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)3p97藥動(dòng)學(xué)計(jì)算程序處理。

3 結(jié)果

3.1 水飛薊賓乳脂體粒徑、Zeta電位和包封率

測(cè)得水飛薊賓乳脂體平均粒徑為364.1 nm，且粒徑分布均勻。Zeta電位為－34.1 mV。測(cè)得水飛薊賓乳脂體的包封率為82.5%。

3.2 體內(nèi)方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 方法專屬性考察 由圖1可見，在此液相條件下，水飛薊賓分離得到水飛薊賓A(1)和水飛薊賓B(2)兩個(gè)峰。水飛薊賓兩個(gè)峰均能達(dá)到基線分離且峰形穩(wěn)定，保留時(shí)間約為 15.2 min、17.5 min。血漿中雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定。

圖1 大鼠血漿HPLC圖

3.2.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 由表1可知，大鼠血漿3種質(zhì)量濃度各質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)得的平均值偏離實(shí)際加入量均小于15%，定量限附近 RSD%小于20%，可滿足生物樣品測(cè)定要求。

表1 水飛薊賓在大鼠血漿中的回收率 (n=3)

由表2可知，大鼠血漿3種質(zhì)量濃度日內(nèi)、日間精密度RSD%均小于15%，定量限附近RSD%小于20%，滿足生物樣品分析方法要求。

表2 精密度實(shí)驗(yàn) (n=5)

3.3 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果分析

3.3.1 血藥濃度-時(shí)間曲線 大鼠分別尾靜脈注射SIL溶液劑和SIL乳脂體后的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 SIL溶液和乳脂體大鼠靜脈給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線圖 (n=6)

3.3.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究 分別將水飛薊賓乳脂體和水飛薊賓溶液劑的血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)代入中國(guó)藥理學(xué)會(huì)推薦的3p97程序，以AIC和擬合優(yōu)度(r2)為判別指標(biāo)，確定血藥濃度隔室模型。以1為權(quán)重對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型嵌合，結(jié)果，二種制劑均符合二室模型，其相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

表3 SIL溶液劑和乳脂體大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (n=6)

從二者的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知，將SIL包封于乳脂體中能明顯改善其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，與自制的SIL溶液劑相比，t1/2β、CL、AUC、和 MRT 均有顯著性差異。

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)成功地采用薄膜分散法制備了SIL乳脂體，結(jié)果表明，采用薄膜分散法制得的乳脂體為淡藍(lán)色略透明的混懸液。平均粒徑為364.1 nm，且粒徑分布均勻。Zeta電位為－34.1 mV。包封率為82.5%。

4.2 天然或合成的水飛薊賓并非單一化合物，而是一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體(水飛薊賓A和水飛薊賓B)的混合物，且它們都具有藥理活性，為了便于計(jì)算，將水飛薊賓A和水飛薊賓B兩個(gè)峰的峰面積之和作為定量用。

4.3 本研究制備了注射用水飛薊賓乳脂體，大大提高了水飛薊賓的生物利用度。

4.4 本研究建立了HPLC測(cè)定大鼠血漿中SIL的含量，應(yīng)用本方法，研究了大鼠尾靜脈分別注射SIL乳脂體和SIL溶液劑后，其血漿中的藥物濃度，由大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，二種制劑均符合二室模型。以乳脂體作為SIL的載體制備靜脈注射制劑，與自制的 SIL溶液劑相比，t1/2β、CL、AUC 和MRT均有顯著性差異。t1/2β由16.06 min延長(zhǎng)到35.98 min，CL 由 0.29 mL/min 減小到 0.16 mL/min、AUC 增大2.22 倍，MRT 增大 2.51 倍，提示水飛薊賓乳脂體改變了水飛薊賓的體內(nèi)消除，顯著延長(zhǎng)水飛薊賓的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)制得的乳脂體，中心具有固體或者半固體的疏水核，外周又被磷脂層穩(wěn)定，水飛薊賓等親脂性藥物能被高濃度地包裹入疏水核中，使藥物的釋放需克服疏水核和磷脂層的雙重屏障，具有緩控釋作用。

4.5 試驗(yàn)分別采用甲醇沉淀法和乙腈沉淀法，結(jié)果表明，乙腈對(duì)蛋白的沉淀作用優(yōu)于甲醇，藥物回收率高。

4.6 本研究用一種簡(jiǎn)單的方法制備了具有多重優(yōu)點(diǎn)的SIL乳脂體注射劑，為SIL臨床用藥提供一種高療效的制劑品種。

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