南五味子、五味子HPLC指紋圖譜研究和木脂素成分測定

李曉亮， 易進(jìn)海， 劉云華， 朱美曉， 吳 燕

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000;2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都 610041;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 611137)

南五味子為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)，五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz)Baill.的干燥成熟果實(shí)，二者具有相同的功能與主治［1］。現(xiàn)行版中國藥典分別以五味子酯甲、五味子醇甲作為南五味子、五味子的質(zhì)量控制指標(biāo)，這種傳統(tǒng)的單一指標(biāo)的質(zhì)量控制模式，難以反映藥材的真實(shí)質(zhì)量。HPLC指紋圖譜技術(shù)［2-6］具有適用選擇性強(qiáng)、范圍廣、靈敏度高、分離性能好等優(yōu)點(diǎn)，是一種評(píng)價(jià)天然藥物一致性和穩(wěn)定性的綜合多要素質(zhì)量控制方法。譚春梅等［7］、李學(xué)龍等［8］對(duì)南五味子和五味子指紋圖譜進(jìn)行了研究，但共有峰少、主要色譜峰分離效果差。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過大量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC指紋圖譜，分析時(shí)間短，共有峰多且主要定量峰達(dá)到基線分離，兼具有定性和定量的作用，為全面控制南五味子、五味子藥材質(zhì)量提供科學(xué)方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(包括四元泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站);KQ-100超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);島津AUW220D型十萬分之一電子天平。乙腈、四氫呋喃為美國Tedia色譜純;水為樂百氏純凈水;其余試劑均為分析純。

五味子酯甲對(duì)照品(批號(hào):1529-200001)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào):0764-200107)、五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):1529-200001)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào):110765-200609)均購自中國藥品生物制品檢定所。

14批南五味子藥材和7批五味子藥材經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定分別為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd.et Wils.和五味子Schisandra chinensis(Turcz)Baill的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18分析柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相 A 相為乙腈，B相為水-四氫呋喃(3∶1)，梯度洗脫程序:0～35 min，流動(dòng)相A由8% ～20%，B由92% ～80%;35～45 min，流動(dòng)相A由20% ～35%，B由80% ～65%;45～55 min，A 為35%，B 為65%，55～65 min，A 由35% ～40%，B由65% ～60%;體積流量1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長220 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取五味子酯甲對(duì)照品 5.33 mg、五味子甲素對(duì)照品 5.77 mg、五味子醇甲對(duì)照品6.55 mg、五味子乙素對(duì)照品4.69 mg，置同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制成五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素的混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為213.2 mg/L、230.8 mg/L、262.0 mg/L、187.6 mg/L。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取南五味子、五味子藥材粉末(過三號(hào)篩)約1.0 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(100 W，40 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 南五味子、五味子指紋圖譜研究

3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(南五味子S1)，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.4%，相對(duì)峰面積RSD＜1.5%，相似度為0.99，表明儀器精密度好。

3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(南五味子 S1)，分別于0、2、4、8、16、24 h 測定，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.4%，相對(duì)峰面積RSD＜1.4%，相似度為0.98，表明供試品溶液于24 h內(nèi)測定穩(wěn)定。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同批樣品(南五味子S1)5份，精密稱定，分別制備供試品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.6%，相對(duì)峰面積RSD＜1.6%，相似度為0.99，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好。

3.4 南五味子、五味子指紋圖譜的建立

3.4.1 南五味子藥材色譜指紋圖譜共有模式的建立 取不同來源的南五味子藥材(S1～S14)粉末，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄65 min的HPLC圖，采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，將其它樣品的色譜峰與參照?qǐng)D譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成南五味子藥材指紋圖譜共有模式(即對(duì)照?qǐng)D譜，見圖1)，計(jì)算1～14批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜相似度，分別為0.986、0.994、0.988、0.988、0.996、0.995、0.990、0.965、0.981、0.985、0.932、0.932、0.977、0.977。14 批南五味子藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度均大于0.9，說明相似度良好。見圖2。

圖1 南五味子對(duì)照?qǐng)D譜Fig.1 The reference map of Schisandrae sphenantherae Fructus

3.4.2 五味子藥材色譜指紋圖譜共有模式的建立

同3.4.1項(xiàng)下方法建立五味子藥材指紋圖譜共有模式(即對(duì)照?qǐng)D譜，見圖3)，計(jì)算1～7批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜相似度，分別為 0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.997、0.997。7批五味子藥材指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度均大于0.9，說明相似度良好。見圖4。

圖2 南五味子指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of Schisandrae sphenantherae Fructus

3.4.3 共有指紋峰的標(biāo)定 將南五味子及五味子藥材的指紋圖譜峰鎖定在5 min～65 min共有指紋區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用相對(duì)保留時(shí)間從14批南五味子樣品圖譜的共有指紋區(qū)標(biāo)定了25個(gè)共有峰，從7批五味子樣品圖譜的共有指紋區(qū)標(biāo)定了24個(gè)共有峰，分別經(jīng)過與對(duì)照品比對(duì)并結(jié)合DAD光譜，可知1號(hào)峰為五味子醇甲，12號(hào)峰為五味子酯甲，15號(hào)峰為五味子甲素，21號(hào)峰為五味子乙素(圖1、圖3)。14批南五味子樣品及7批五味子樣品出峰總數(shù)及共有峰占總峰面積百分比見表1。

圖3 五味子對(duì)照?qǐng)D譜Fig.3 The reference map of Schisandrae chinensis Fructus

表1 樣品來源及指紋圖譜數(shù)據(jù)Tab.1 Sources of samples and data of HPLC fingerprint

圖4 五味子指紋圖譜Fig.4 Fingerprints of Schisandrae chinensis Fructus

3.4.4 南五味子、五味子指紋圖譜比較 采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004B)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，以南五味子對(duì)照?qǐng)D譜作為參照?qǐng)D譜，計(jì)算14批南五味子和7批北五味子圖譜的相似度，結(jié)果見表1，表明南五味子、五味子指紋圖譜差異很大，顯著不同。南五味子中五味子酯甲、五味子甲素的量遠(yuǎn)大于五味子，而五味子中五味子醇甲的量遠(yuǎn)大于南五味子，但二者總木脂素量相當(dāng)，具體數(shù)據(jù)見表2。

4 南五味子、五味子中4種木脂素的測定

4.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙素與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。理論塔板數(shù)按五味子酯甲計(jì)大于5 000。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖5。

表2 五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.2 Contents of deoxyschizandrin，schisantherrin A，Schisandrin and γ-schisandrin

圖5 對(duì)照品及藥材樣品HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of control solution and sample solution

4.2 線性關(guān)系 精密吸取對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL 依次分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X，峰面積(A)為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，五味子酯甲:Y=5 164.06X+1.73，r=0.999 9;五味子甲素:Y=6 006.40X+1.65，r=0.999 9;五味子醇甲:Y=5 832.03X+1.75，r=0.999 9;五味子乙素Y=5 316.11X+1.69，r=0.999 9。結(jié)果表明五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素分別在 0.426 4 ～ 2.558 μg、0.461 6 ～ 2.770 μg、0.524 0 ～3.144 μg、0.375 2 ～2.251 μg 范圍呈良好的線性關(guān)系。

4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄峰面積。五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙峰面積RSD分別為0.3%、0.2%、0.6%、0.3%，表明儀器精密度良好。

4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同批次藥材粉末5份，照2.2項(xiàng)下方法制供試品溶液，依法測定峰面積，五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素含量RSD分別為0.3%、0.9%、0.4%、0.5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液于室溫放置，分別于0、1、2、4、8、16、24 h 依法測定，記錄峰面積。五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素峰面積 RSD 分別為 0.3%、0.2%、0.6%、0.3%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

4.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取上述已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)同批次藥材粉末0.1 g，5份，分別精密加入五味子酯甲(213.2 mg/L)、五味子甲素(230.8 mg/L)、五味子醇甲(262.0 mg/L)、五味子乙素(187.6 mg/L)對(duì)照品溶液各2.5 mL，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液。依法測定，計(jì)算回收率，五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素平均回收率分別為97.5%(RSD 為 2.3%)、94.8%(RSD 為 3.1%)、103.7%(RSD 為 1.6%)、98.2%(RSD 為 1.1%)。4.7 測定 取各批次藥材粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，分別依2.3項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表2。

5 討論

5.1 本實(shí)驗(yàn)比較了文獻(xiàn)報(bào)道的多種流動(dòng)相系統(tǒng)，甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)等［8-12］分離效果均不理想。本實(shí)驗(yàn)在乙腈-水系統(tǒng)中加入適量的四氫呋喃，比較了Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)和 Synergi Hydro-rp C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，4 μm)，在該色譜條件下梯度洗脫時(shí)間大大縮短，分離得到25個(gè)共有峰且主要定量峰達(dá)到基線分離，兼具有定性和定量的作用，系統(tǒng)適用性良好。

5.2 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示不同產(chǎn)地南五味子指紋圖譜相似度大于0.9，但其主要木脂素成分量差異較大;不同產(chǎn)地五味子指紋圖譜相似度亦大于0.9，但南五味子、五味子指紋圖譜相似度小于0.3，表明南五味子、五味子指紋圖譜特征性和專屬性強(qiáng)。南五味子中五味子酯甲和五味子甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)大于五味子，而五味子中五味子醇甲質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)大于南五味子，但二者木脂素總量相當(dāng)。因此，指紋圖譜結(jié)合木脂素成分的測定，可為全面控制南五味子、五味子藥材的質(zhì)量提供科學(xué)方法。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:227.

［2］謝 青.現(xiàn)代色譜技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用［J］.海峽藥學(xué)，2007，19(11):95-98.

［3］胡育筑，孟慶華，劉永鎖，等.中藥色譜指紋譜的質(zhì)量控制方法［J］.色譜，2004，2(24):361.

［4］謝培山.中藥色譜指紋圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:124.

［5］王麗聰，曹玉華，徐紅蘭，等.銀黃口服液的質(zhì)量控制及其高效液相色譜指紋圖譜的研究［J］.色譜，2006，24(4):367.

［6］馬麗萍，丘小惠，閔 江，等.高良姜飲片HPLC指紋圖譜及高良姜素含量測定研究［J］.中成藥，2008，30(11):1565-1569.

［7］譚春梅，黃琴偉，張文婷，等.五味子和南五味子的HPLC指紋圖譜研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25(6):514-517.

［8］李學(xué)龍，楊 博，徐 鵬，等.南五味子液相色譜指紋圖譜研究［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(1):4-8.

［9］代云桃，金高娃，秦雪梅，等.五味子提取物高效液相色譜分析方法的優(yōu)化［J］.色譜，2009，27(4):442-446.

［10］宋平順，丁永輝，趙建邦.南五味子不同炮制品中五味子酯甲和五味子甲素含量的 HPLC法測定［J］.中藥材，2008，31(5):652-654.

［11］耿立超，楊中林.HPLC法測定不同產(chǎn)地五味子中木脂素的含量［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35(2):47-48.

［12］楊 博，陳 彤，李學(xué)龍，等.高效液相色譜法測定南、北五味子中木脂素含量［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(2):102-106.