元胡炮制前后UPLC指紋圖譜研究

張 虹， 王 麟， 陳相濤， 袁 珂*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)天然藥物研發(fā)中心，浙江 臨安311300；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450008）

元胡炮制前后UPLC指紋圖譜研究

張 虹1， 王 麟2， 陳相濤1， 袁 珂1*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)天然藥物研發(fā)中心，浙江 臨安311300；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450008）

目的 建立元胡炮制前后的UPLC指紋圖譜。方法 將元胡趁鮮切片，加醋后烘干得醋制元胡。元胡生、制品各10批，采用ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，PDA檢測器，以0.2%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，選擇色譜圖出峰數(shù)目最多，各色譜峰分離度較好的297 nm為檢測波長，柱溫30℃，體積流量0.3 mL/min。結(jié)果 以延胡索乙素作為參照，確定元胡生品有32個共有色譜峰，元胡制品有23個共有色譜峰。結(jié)論 從整體上顯示了生、制品的特征，炮制后多種未知成分的量下降或消失。建立的UPLC指紋圖譜方法為元胡生、制品的質(zhì)量控制提供有效手段。關(guān)鍵詞：UPLC；元胡；炮制；指紋圖譜

中藥指紋圖譜是采用一定的分析手段，得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖［1］，它是一種綜合的鑒定手段，是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于分析評價中藥材、中藥飲片及中藥制劑的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，具有“整體性”和“模糊性”兩大特點［2］。

延胡索為罌粟科植物Corydalis yanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，又稱元胡，為常用理氣止痛藥，具有活血、利氣、止痛的功能。用于胸脅、脘腹疼痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后瘀阻，跌撲腫痛等癥［3］。歷代對元胡的炮制有生用、炒、醋炙、酒炙、醋煮、鹽炙等，現(xiàn)多采用醋炙、醋煮和醋蒸，部分地區(qū)沿用酒炙和鹽炙?！吨袊幍洹?010年版載有生元胡和醋元胡。元胡為浙八味之一，主產(chǎn)于磐安、東陽一帶。多年來因元胡藥材產(chǎn)地加工過程多由藥農(nóng)自己完成、且加工方法不規(guī)范，導(dǎo)致藥材質(zhì)量存在一定差異，造成目前藥源質(zhì)量不穩(wěn)定和市售元胡飲片質(zhì)量無法正確評估的混亂局面。

元胡作為臨床常用藥，其藥材的HPLC指紋圖譜已有報道，但建立元胡生、制品UPLC指紋圖譜鑒定技術(shù)的研究尚未見文獻(xiàn)報道。為綜合評價和分析飲片質(zhì)量，本實驗建立元胡生、制品UPLC指紋圖譜，以全面、客觀地分析評價元胡所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，為元胡藥材及元胡飲片的綜合質(zhì)量控制提供參考，以確保藥材及飲片品質(zhì)的一致性，療效的可靠性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國Waters公司），配備二元溶劑管理器、自動進(jìn)樣器和PDA檢測器；Masslynx色譜工作站。舒美KQ2200DE數(shù)控超聲儀，AUTO SCIENCE溶劑過濾裝置，森信DGG-9240A型干燥箱，Millipore公司Milli-Q 超純水儀（Bedford，MA，USA）。

1.2 試劑 延胡索乙素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110726-200409）；甲醇為色譜純；甲酸為分析純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品 元胡藥材（生品）采集于磐安、東陽不同的時間，經(jīng)浙江林學(xué)院樓爐煥教授鑒定為罌粟科植物元胡的新鮮塊莖。制元胡通過炮制工藝優(yōu)選，對元胡鮮品進(jìn)行一體化加工。以元胡趁鮮切片的厚度、加醋量和干燥溫度為考察因素，每個因素設(shè)定三個水平，以延胡索乙素為指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計，優(yōu)選出延胡索醋炙的最佳工藝，即將元胡鮮品采用搶水洗的方法除去外表泥沙，瀝干水分即可趁鮮切片4 mm，以加醋量40%的米醋少量多次噴淋的方法，噴淋后將其用保鮮膜覆蓋悶潤，至醋被吸盡，然后在50℃下干燥得到醋制元胡。所測樣品詳見表1。

表1 元胡生品來源Tab.1 Sample resoures of Corydalis Rhizoma

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取一定量的延胡索乙素對照品，置量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成濃度為46 μg/mL的對照品溶液。

2.2 樣品溶液的制備 取元胡生品、制品粗粉各0.5 g甲醇（1∶20）溶液50 mL，冷浸1 h，加熱回流1 h。放冷，濾過，蒸干濾液，殘渣加甲醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜作為供試液。

2.3 色譜條件 色譜柱為Waters公司ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為0.2%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脫程序見表2。柱溫：30℃；體積流量：0.3 mL/min；檢測波長 297 nm；進(jìn)樣量為 10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Procedure of gradient elution with mobile phase

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（5號生品）連續(xù)進(jìn)樣6次分析，比較各主要特征峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD值小于3.0%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜分析要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（5號生品）6份，每份約0.2 g，精密稱定，按上述供試液制備方法制備后分別進(jìn)樣進(jìn)行測定，比較各主要特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD值小于3.0%，表明方法的重復(fù)性良好，符合指紋圖譜分析要求。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（5號生品），分別在 0、1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，比較各主要特征峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果RSD值小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 元胡生品指紋圖譜共有模式的建立及相似度比較

2.5.1 元胡生品指紋圖譜共有模式的建立及特征峰的標(biāo)定 按供試液制備方法制備供試液，按照確定的色譜條件分別進(jìn)樣進(jìn)行UPLC測定，記錄UPLC圖譜，在25 min內(nèi)出現(xiàn)32個共有峰，通過對照品UPLC圖譜確定，其中10號峰為延胡索乙素。以延胡索乙素作為參照峰，其他依次標(biāo)記為1、2……32。各特征峰的相對峰面積及相對保留時間均具有較好的重復(fù)性。元胡生品的特征指紋峰的相對保留時間的RSD均低于0.5%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》［4］的要求，元胡生品的對照指紋1， 10的疊加圖見圖2，各主要特征峰的相對峰面積見表3。

圖1 元胡生品的對照指紋圖譜Fig.1 Compared fingerprint of Corydalis Rhizoma

圖2 元胡生品10批供試品的共有模式圖Fig.2 Intercommunity pattern of Corydalis Rhizoma

表3 元胡生品指紋圖譜主要特征峰的相對峰面積Tab.3 Relative peak area of Corydalis Rhizoma

2.5.2 不同產(chǎn)地及批次元胡生品的相似度比較利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對10批產(chǎn)地及批次的元胡生品進(jìn)行相似度評價，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明10批元胡生品具有良好的相似度。

表4 10批元胡生品的相似度計算結(jié)果Tab.4 Similitude degree result of Corydalis Rhizoma

2.6 元胡制品指紋圖譜共有模式建立及相似度比較

2.6.1 元胡制品指紋圖譜共有模式的建立及特征峰的標(biāo)定 按供試液制備方法制備供試液，按照確定的色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄UPLC圖譜，25 min內(nèi)有23個共有峰，通過對照品UPLC圖譜確定，其中11號峰為延胡索乙素。以延胡索乙素作為參照峰，其他依次標(biāo)記為1、2……23。各特征峰的相對峰面積及相對保留時間均具有較好的重復(fù)性。元胡制品的特征指紋峰的相對保留時間的RSD均低于0.5%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》［4］的要求。元胡制品的對照指紋圖譜見圖3，特征指紋峰的共有模式的10批供試品的疊加圖見圖4，各主要特征峰的相對峰面積見表5。

2.6.2 不同產(chǎn)地及批次元胡制品藥材樣品的相似度比較 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對10批元胡制品進(jìn)行相似度評價，結(jié)果見表6，實驗結(jié)果表明每個產(chǎn)地的5批藥材制品相似度較好，東陽產(chǎn)元胡炮制后較生品出現(xiàn)了6號非共有峰。

圖3 元胡制品的對照指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of processed Corydalis Rhizoma

圖4 元胡制品10批供試品共有模式圖Fig.4 Intercommunity pattern of processed Corydalis Rhizoma

表5 元胡制品指紋圖譜主要特征峰的相對峰面積Tab.5 Relative peak area of processed Corydalis Rhizoma

表6 10批元胡制品的相似度計算結(jié)果Tab.6 Similitude degree result of processed Corydalis Rhizoma

3 討論

3.1 根據(jù)指紋圖譜對元胡提取液進(jìn)行分析，結(jié)果表明，按照藥典方法以甲醇-氨水（20∶1）作為提取溶劑，可以使元胡中的生物堿游離，進(jìn)而增加其溶出度，且此方法提取10批生品樣品的相似度均大于0.9，說明采用現(xiàn)有提取工藝制備的樣品，每個批次間一致性較好，該方法可用于元胡提取液的質(zhì)量控制。

3.2 本實驗對元胡提取液指紋圖譜的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。延胡索乙素為元胡鎮(zhèn)痛的主要成分，故作為參比峰。采用二極管陣列檢測器（PDA），在分析時進(jìn)行全波長紫外掃描，并在不同波長下獲取數(shù)據(jù)，經(jīng)比較后表明297 nm色譜圖峰形最好，出峰數(shù)目最多，各色譜峰相互之間分離度較好，故檢測波長選定在297 nm波長下確定元胡生、制品的指紋圖譜。

3.3 采用不同比例的甲醇-水梯度系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，甲醇在較低波長下吸收度較強，梯度洗脫時基線漂移嚴(yán)重，且色譜峰無法成形，而在酸性條件下有較好的色譜峰分離，經(jīng)過多次調(diào)整甲酸的比例，最后選取0.2%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動相。

3.4 從表6中所列相似度結(jié)果可以看出，每個產(chǎn)地元胡制品的相似度較接近，但兩個產(chǎn)地元胡制品色譜圖的相似度間有較大的差異，經(jīng)對比兩產(chǎn)地制品的對照圖譜發(fā)現(xiàn)，二者的差異主要表現(xiàn)在磐安產(chǎn)元胡制品的色譜圖中的6號（如圖3）色譜峰較東陽產(chǎn)元胡制品色譜圖中的6號色譜峰峰高較高，峰面積較大，除此，二者基本相似。

3.5 將元胡生品和制品的對照指紋圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，炮制后色譜峰的數(shù)目發(fā)生變化（生品為32個色譜峰，制品為23個色譜峰），另外有些保留時間相同的色譜峰的峰面積也發(fā)生了一定的變化，如制品的7號色譜峰（tR為3.417 min）和生品的6號色譜峰（tR為3.42 min）保留時間相同，但峰面積相對變小，這一成分結(jié)構(gòu)和藥效將有待于進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

4.1 傳統(tǒng)的HPLC指紋圖譜由于液相色譜柱效較低，分離時間較長，一般都在1 h以上［5-6］，不能滿足高通量分析的要求，制約著液相色譜指紋圖譜在實際質(zhì)量控制中的應(yīng)用。而超高效液相色譜的出現(xiàn)解決了這一技術(shù)難題，UPLC指紋圖譜技術(shù)能大大縮短樣品運行的時間［7］，作為理想的中藥質(zhì)量控制的手段，有著廣闊的應(yīng)用前景。

4.2 本研究通過建立元胡生、制品的UPLC指紋圖譜，對10批生、制品進(jìn)行了指紋圖譜測定。測定結(jié)果顯示，不同生品供試品與制品供試品的色譜概貌一致，整體分離度較好，生品供試品有32個共有峰，相似度均大于0.99，制品供試品有23個共有峰，相似度均大于0.82，具有自身化學(xué)條碼特征，建立的共有模式比較可靠，能反映其內(nèi)在的化學(xué)成分種類和數(shù)量，以此作為控制元胡生品、制品質(zhì)量的方法，元胡生品與其對照指紋圖譜的相似度不得低于0.9，制品與其對照指紋圖譜相似度不得低于0.8，此方法比較科學(xué)有效。

［1］謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用［J］.中國中藥雜志，2001，26（10）：653.

［2］謝培山.中藥色譜指紋圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005，2：12.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：130-131.

［4］國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）［J］.中成藥，2000，22（10）：671-675.

［5］Xu Lina，Xu Han，Qi Yan，et al.Multiple compounds determination and fingerprint analysis of Lidanpaishi Tablet and keli by highperformance liquid chromatography［J］.Anal Chim Acta，2009，633（1）：136-148.

［6］Ye Ji，Zhang Xi，Dai Weixing，et al.Chemical fingerprinting of Liuwei Dihuang Pill and simultaneous determination of its major bioactive constituents by HPLC coupled with multiple detections of DAD，ELSD and ESI-MS［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，49（3）：638-645.

［7］Zhou Dayong，Zhang Xiuli，Xu Qing，et al.UPLC/Q-TOFMS/MS as a powerful technique for rapid identification of polymethoxylated flavones inFructus aurantii［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，50（1）：2-8.

UPLC fingerprint of crude and processed Corydalis Rhizoma

ZHANG Hong1， WANG Lin2， CHEN Xiang-tao1， YUAN Ke1*
（1.Research and Development Certer of Natural Medicine，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin’an 311300，China；2.College of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

AIMTo establish the fingerprint of crude and processedCorydalis Rhizomaby UPLC.METHODSTen batches of slicedCorydalis Rhizomawere added vinegar and boiled to dryness as the processed along with another ten batches of unprocessedCorydalis Rhizomafor experiment.The UPLC analysis was carried out on an ACQUITY UPLC?BEH C18column，with a detector of PDA and the mobile phase consisting 0.2%formic acid water-0.1%formic acid methanol in gradient mode.The detection wavelength was set at 297 nm that more peaks can be detected.The column temperature was 30 ℃，and flow rate was 0.3 mL/min.RESULTSThirty-two and twenty-three co-possessing peaks were selected as the fingerprint peaks of crude and processedCorydalis Rhizoma，respectively，based on the peak area of corydalis B as reference peak.CONCLUSIONThe method of UPLC fingerprint can display the feature of crude and processedCorydalis Rhizoma.After processing various chemical constituents are reduced and disappeare.It provides the effective means for quality control of crude and processedCorydalis Rhizoma.

UPLC；Corydalis Rhizoma；processed；fingerprint

R284.1

A

1001-1528（2011）07-1093-05

2010-06-02

浙江省科技廳重點項目（2007C23024）

張 虹（1982—），女，講師，主要從事中藥飲片炮制研究。

* 通信作者: 袁珂，女，教授，主要從事天然藥物活性成分研究。Tel: ( 0571) 63743607，E-mail: yuan_ke001@163.com