川芎嗪、阿魏酸微透析體外回收率及體內(nèi)穩(wěn)定性的研究

王利勝， 石宗豐， 郭 琦， 劉宏偉， 賴寶林

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

微透析技術(shù)(microdialysis)是一種直接進(jìn)行組織采樣分析的方法，可通過探針的回收率(recovery)計(jì)算組織中藥物的濃度［1］。在國(guó)際上已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人體的研究，其在藥動(dòng)學(xué)研究中特別是局部藥動(dòng)學(xué)中具有其他藥動(dòng)學(xué)方法難以取代的地位，在中藥及其復(fù)方研究中則少見相關(guān)報(bào)道。

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)、川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)分別是當(dāng)歸、川芎中的主要有效成分，在傳統(tǒng)復(fù)方四物湯、佛手散、補(bǔ)陽(yáng)還五湯等含量較高。TMP是當(dāng)歸、川芎中的主要活性生物堿，現(xiàn)代研究表明［2］TMP具有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用。FA是川芎中的主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其在抗氧化、清除自由基、有效抑制血小板聚集和血栓形成等方面具有確切的藥理活性，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具保護(hù)作用［3－4］。本課題組在前期的研究中建立了TMP在小鼠血漿、腦、肝中含量的HPLC法［5］，發(fā)現(xiàn)采用微乳這種納米微粒載藥體系可以提高TMP在腦內(nèi)的分布［6］。在此基礎(chǔ)上開發(fā)了復(fù)方芎冰微乳，主要含有TMP和FA成分，經(jīng)過藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有良好的保護(hù)大鼠腦缺血方面的作用［7］。實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)研究方法往往每一只動(dòng)物只能獲得一個(gè)數(shù)據(jù)，需要用大批量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物才能獲得完整的藥時(shí)數(shù)據(jù)，個(gè)體差異大。近年來(lái)，由于微透析技術(shù)可以使用更少的動(dòng)物數(shù)而獲得更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息［8］，其在藥動(dòng)學(xué)領(lǐng)域的研究已成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)。為了利用微透析取樣技術(shù)同時(shí)進(jìn)行中藥及復(fù)方中FA、TMP的在體藥動(dòng)學(xué)研究，本實(shí)驗(yàn)初步確定了探針回收率的校正方法及其穩(wěn)定性，現(xiàn)報(bào)道如下:

圖1 阿魏酸、川芎嗪HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of FA/TMP by microdialysis sampling

1 儀器與試藥

1.1 儀器 waters高效液相色譜儀(Waters 515泵，Waters2487檢測(cè)器);瑞典CMA402灌注器推進(jìn)泵、灌注器;MAB7.40.10同心圓型血液探針(截留分子量15 000D);AUW120D十萬(wàn)分之一分析天平(日本島津)。

1.2 藥物與試劑 阿魏酸、鹽酸川芎嗪對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):110773－200611、110817－200305);川芎嗪 (澤朗植提，含量≥98.5%)。乙腈、水均為色譜級(jí)，其他試劑為分析級(jí)。

1.3 其他 SD大鼠，SPF級(jí)，體重280～320 g(許可證號(hào):SCXK(粵)2008－0020)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 微透析液中FA、TMP含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 迪馬 platisil ODS柱(5 μm，250 mm×4.6 mm);Phenomenex保護(hù)柱;流動(dòng)相:乙腈－0.5%冰乙酸(36:64);流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為307 nm;外標(biāo)法定量。

2.1.2 專屬性考察 大鼠麻醉后并植入血液探針，收集空白透析液為空白樣品。平衡1 h后灌流液改為FA/TMP濃度分別為0.54/0.92 μg/mL的含藥林格氏液，并收集血液透析樣品，進(jìn)樣分析，結(jié)果表明透析液中FA、TMP峰形良好，分別在約4.7、6.2 min出峰，分離度及對(duì)稱因子均符合要求，可知在本實(shí)驗(yàn)條件下的分析方法具有良好的專屬性。見圖1。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取五氧化二磷中干燥至恒重的FA、鹽酸川芎嗪對(duì)照品，分別精密稱取2.60 mg和3.04 mg(相當(dāng)于TMP 1.98 mg)，加適量甲醇溶解并用林格氏試液定容至20 mL，再用林格氏試液將其稀釋1 000倍后作為對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、4、8、10、15、20 μL 后記錄峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得FA回歸方程:Y=4.635 8X+143.98，R=1.000 0;TMP回歸方程為:Y=2.335 5X+31.967，R=0.999 9;結(jié)果表明，F(xiàn)A進(jìn)樣量在1.3 ng～26.00 ng范圍內(nèi)、TMP在0.99～19.8 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn) 將上述對(duì)照品溶液于冷藏(0～4 ℃)、避光條件下儲(chǔ)存，吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得 FA、TMP峰面積 RSD分別為1.17%、1.04%，說明儀器精密度良好;每隔2 h進(jìn)樣3次并記錄峰面積，結(jié)果樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD＜2.5%)。

2.2 微透析試驗(yàn)

2.2.1 林格氏液及含藥林格氏液的配制 分別稱取 8.599 gNaCl、0.144 gCaCl2、0.298 gKCl溶解于超純水中，并定容至1 000 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得林格氏液。另精密稱取FA、TMP適量，用林格氏液超聲溶解，即得含藥林格氏液。

2.2.2 流速對(duì)相對(duì)回收率(Relative Recovery，RR)及相對(duì)損失率(Relative Loss，RL)的影響 用空白林格氏液在不同流速(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL/min)灌流置于FA/TMP濃度分別為0.84/0.97 μg/mL的含藥林格氏液的血液探針。每種流速在平衡0.5 h后收集5份樣品(每份樣品30 μL，下同)，HPLC測(cè)定接收品濃度Cdialysis和原藥液中藥物濃度Cperfusate，按公式 RR=Cdialysis/Cperfusate×100%(公式1)計(jì)算RR;

用FA/TMP濃度分別為0.93/0.95 μg/mL的含藥林格氏液分別在以上流速下灌流置于空白林格氏液中的血液探針，平衡0.5 h后收集5份樣品，接樣的同時(shí)取相應(yīng)一份原藥液，HPLC測(cè)定接收品Cdialysis和原藥液中藥物濃度Cperfusate，按公式 RL=(Cperfusate－Cdialysis)/Cperfusate×100%(公式 2)計(jì)算RL。

不同流速下FA、TMP的RR及RL結(jié)果取平均值，結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，隨著流速的增加，F(xiàn)A、TMP的回收率呈降低趨勢(shì)，RR與RL在各種流速下均基本一致，這為反透析法進(jìn)行探針回收率校正提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖2 不同流速對(duì)FA、TMP的RR、RL影響Fig.2 The effect on RR and RL under different flow rate

2.2.3 藥物濃度對(duì)回收率的影響 體內(nèi)微透析試驗(yàn)中，探針周圍的藥物濃度是實(shí)時(shí)變化的，為了保證透析液中藥物濃度變化能正確反映組織中藥物濃度的變化，探針回收率大小必須相對(duì)穩(wěn)定。

將探針分別植入FA/TMP濃度分別為2.51/2.57、1.63/1.55、0.97/1.03、0.48/0.50、0.25/0.24 μg/mL的含藥林格氏液，以空白林格氏液1.5 μL/min流速灌流探針，每種濃度中平衡0.5 h后收集5份樣品，HPLC測(cè)定樣品和含藥林格氏液中藥物濃度，按公式1計(jì)算回收率，每組取平均值;結(jié)果見圖3。

圖3 不同F(xiàn)A、TMP濃度對(duì)探針RR的影響Fig.3 The effect on RR under different FA/TMP concentration

結(jié)果顯示，當(dāng)以1.5 μL/min的流速灌注探針時(shí)，在5種不同藥物濃度的透析媒體中，所得回收率很接近。以回收率對(duì)濃度作圖，結(jié)果為一條與x軸大致平行的直線，表明在一定濃度范圍內(nèi)，探針對(duì)FA、TMP的回收率與濃度無(wú)關(guān)。

2.2.4 體內(nèi)RL的穩(wěn)定性考察 由于動(dòng)物體內(nèi)的藥物實(shí)際濃度是未知的，所以探針真正的體內(nèi)RR是無(wú)從測(cè)得的。前面已證明，相同條件下，RR與RL差別不大，說明RL可代替RR進(jìn)行體內(nèi)校正。但是，體內(nèi)微透析試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間一般較長(zhǎng)，同一根探針常常需要連續(xù)灌流幾個(gè)小時(shí)甚至是幾十個(gè)小時(shí)，如果在長(zhǎng)時(shí)間的取樣過程中回收率發(fā)生變化，就會(huì)造成試驗(yàn)結(jié)果的可信度降低。

體內(nèi)試驗(yàn)前將探針置肝素鈉注射液中以0.5 μL/min的灌流速度灌流空白林格氏液20 min，使膜內(nèi)外充分飽和肝素鈉注射液，防止在探針植入過程發(fā)生凝血。然后使用FA/TMP濃度分別為0.92/0.96 μg/mL的含藥林格氏液1.5 μL/min流速灌流探針。探針置入方法:SD大鼠，烏拉坦麻醉后鈍性分離頸靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，并在遠(yuǎn)心端剪一小口，將血液探針朝心臟方向植入約2.4 cm，并用縫合線固定探針。平衡1 h后每隔20 min收集一次透析液樣品，灌流10 h，測(cè)定含藥林格氏液和透析液樣品中藥物濃度，按公式2計(jì)算體內(nèi)RL。結(jié)果見圖4。

圖4 體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性考察結(jié)果Fig.4 The stability of RL in vivo

結(jié)果表明，當(dāng)灌流液流速為1.5 μL/min時(shí)，F(xiàn)A、TMP體內(nèi)RL在10 h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，血液探針FA體內(nèi)RL在10 h內(nèi)平均回收率為49.71%，RSD為5.63%;TMP平均體內(nèi)RL為65.16%，RSD為2.50%，均具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。

2.2.5 連續(xù)使用5次的探針回收率的比較 取新探針用林格氏液以2 μL/min的灌流速度灌流5 h以上，使膜內(nèi)外平衡、充分浸濕，并沖洗掉半透膜上的一些小分子，備用。取 SD大鼠5只，其余按2.2.4項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，每只大鼠在平衡1 h后接收5份樣品，測(cè)定含藥林格氏液和透析液樣品中藥物濃度，按公式2計(jì)算體內(nèi)RL。結(jié)果見表1、表2。

表1 同一探針使用5次的FA回收率變化情況(n=5)Tab.1 The variation of RR of FA in 5 times in one probe(n=5)

表2 同一探針使用5次的TMP回收率變化情況(n=5)Tab.2 The variation of RR of TMP in 5 times in one probe(n=5)

實(shí)驗(yàn)表明，同一只探針在使用5次后依然可以保持較高的回收率，但各次之間回收率波動(dòng)較大，說明在每次實(shí)驗(yàn)后均需進(jìn)行體內(nèi)校正。

3 討論

微透析技術(shù)是將灌流取樣和透析技術(shù)結(jié)合起來(lái)并逐漸完善的一種新型生物采樣技術(shù)，相對(duì)于其他生物取樣技術(shù)，微透析技術(shù)具有以下幾個(gè)方面獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［9］:①其最大的優(yōu)點(diǎn)是可在基本上不干擾體內(nèi)正常生命過程的情況下進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)和在線取樣，特別適用于研究生命過程的動(dòng)態(tài)變化;②微透析技術(shù)不改變細(xì)胞外液(ECF)中的液體平衡，既可以對(duì)同一組織進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)采樣，也可以對(duì)同一動(dòng)物進(jìn)行多個(gè)部位采樣，因此，用較少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物就可以得到足夠的數(shù)據(jù)，避免了由于動(dòng)物的個(gè)體差異所造成的實(shí)驗(yàn)誤差;③由于微透析技術(shù)只允許小分子物質(zhì)通過半透膜，大分子的蛋白、脂質(zhì)類物質(zhì)不隨透析液進(jìn)入檢測(cè)裝置，所得樣品干凈，可以直接進(jìn)行樣品分析，省去了繁瑣的樣品前處理步驟;④微透析技術(shù)可以直接對(duì)ECF中的物質(zhì)分析，與采血取樣技術(shù)相比，藥物在ECF中的濃度與其藥理或毒理作用的相關(guān)性更大。

在微透析取樣過程中，組織中物質(zhì)在探針透析膜內(nèi)外的分布處于一種動(dòng)態(tài)平衡中，但是由于探針持續(xù)灌流的溶液，導(dǎo)致了藥物在組織液和灌注液之間的擴(kuò)散不能達(dá)到絕對(duì)的平衡，透析液中的藥物含量只是ECF中的一部分，要低于探針外細(xì)胞間的待測(cè)物的濃度。因此，在應(yīng)用微透析技術(shù)進(jìn)行藥物藥動(dòng)學(xué)研究之前必須要考察微透析探針對(duì)所研究藥物的回收率。而探針回收率的準(zhǔn)確校正是測(cè)定生物體中待測(cè)組分確切濃度的一個(gè)關(guān)鍵問題［10］，回收率的高低受到探針型號(hào)、待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)、灌流液的性質(zhì)、流速等很多因素的影響。目前，探針回收率的校正方法也有多種［11］，包括零凈流量法、反向透析法、外推至零流速法等。其中，反透析法是通過測(cè)定藥物經(jīng)過半透膜時(shí)的流失量即探針對(duì)藥物的相對(duì)損失率(RL)來(lái)間接計(jì)算探針的回收率，該法與零凈通量法都是進(jìn)行體內(nèi)探針校正十分準(zhǔn)確可靠的方法，但反透析法相對(duì)更簡(jiǎn)單易行、省時(shí)［12］。應(yīng)用反透析法校正微透析探針回收率的前提條件是探針的RR和RL相等，而探針對(duì)藥物的相對(duì)回收率和相對(duì)損失率是否相等與藥物本身的性質(zhì)有關(guān)，反透析法并非適用于所有藥物。本實(shí)驗(yàn)通過體外回收率的研究，驗(yàn)證了所使用的微透析探針回收率與濃度無(wú)關(guān)性，這是利用微透析技術(shù)測(cè)定細(xì)胞外液中藥物真實(shí)濃度的前提條件;考察的結(jié)果表明TMP、FA的探針回收率與損失率具有一致性，驗(yàn)證了反透析法測(cè)定藥物體內(nèi)回收率的可行性及合理性，可以以此來(lái)推斷組織中的實(shí)際藥物濃度。

中藥復(fù)方中藥效成分多樣，且理化性質(zhì)各異，能否將微透析法用于復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)研究，首先要確定各種不同成分探針回收率的矯正方法。本實(shí)驗(yàn)擬將微透析技術(shù)應(yīng)用到中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究中，通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)方法探討使用微透析法進(jìn)行中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究的可行性，確定了體內(nèi)可通過反透析法進(jìn)行FA、TMP的回收率測(cè)定。本文的研究結(jié)果為微透析法技術(shù)用于FA、TMP的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法支持。

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