多指標(biāo)正交法優(yōu)選樟幫枳殼飲片炮制工藝

張金蓮， 謝一輝， 何 敏， 龔千鋒， 姚冬琴， 李 果， 張的鳳

(江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004)

枳殼系蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrus aurantiumL.和栽培變種的干燥未成熟果實(shí)。一般于7月果皮尚綠時(shí)采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥。枳殼生用有理氣寬中，行滯消脹的功效，用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，痰飲內(nèi)停，食積不化，臟器下垂［1］。枳殼在臨床上除使用生品外，還常用炮制品，《中國(guó)藥典》收載的炮制品種為麩炒枳殼。江西樟幫法炮制枳殼飲片的特色是需將枳殼上架壓制，切制成“鳳眼片”，麩炒或蜜麩炒［2］。本實(shí)驗(yàn)通過多指標(biāo)正交法來優(yōu)化樟幫枳殼的炮制工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ultimate 3000高效液相色譜儀，ultimate 3000 photodiode Array Detector，ultimate 3000 自動(dòng)進(jìn)樣器，ultimate 3000柱溫箱，ultimate 3000色譜工作站，AG245電子分析天平，Sartorius BS124電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)，高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特一儀器有限公司)，TN408LC型紅外測(cè)溫槍(上海儀迷杰光電技術(shù)有限公司)，KQ3200超聲波清洗器(昆山超聲儀器廠)，GZX－9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 對(duì)照品 柚皮苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110722－200309)、新橙皮苷(由江西中醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊武亮教授提供，含量99.34%);色譜純乙腈(美國(guó)Merck公司)，色譜純甲醇(美國(guó)Merck公司)。其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 枳殼原藥材購(gòu)自江西天齊堂中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥資源學(xué)科組褚小蘭教授鑒定為酸橙Citrus anrantiumL.干燥未成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樟幫枳殼生品工藝研究

2.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以樟幫傳統(tǒng)炮制方法的溫濕度和時(shí)間為基礎(chǔ)，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)的情況，采用L16(45)正交表對(duì)炮制溫度、炮制時(shí)間、炮制濕度三因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每因素設(shè)計(jì)四個(gè)水平，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.1.2 樟幫枳殼生品制備 枳殼原藥材用小刀挖去內(nèi)瓤，洗凈泥沙，撈起，潤(rùn)過夜(12 h)，壓扁，再上木架壓制，依照正交設(shè)計(jì)表L16(45)進(jìn)行飲片炮制后，取出，切成0.2 cm厚的鳳眼片，干燥即得。

2.1.3 柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定

2.1.3.1 色譜條件 色譜柱:ultimate 3000 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈－水(磷酸調(diào)pH值至3)(23∶77)，檢測(cè)波長(zhǎng):283 nm，流速:1.0 mL/min，柱溫:30℃。理論塔板數(shù)以柚皮苷計(jì)不低于3 000。對(duì)照品溶液、供試品溶液和溶劑的色譜圖見圖1。

2.1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，加無水甲醇制成每1 mL含柚皮苷對(duì)照品0.079 12 mg、新橙皮苷對(duì)照品0.047 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3.3 供試品溶液的制備 取枳殼粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3.4 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液按2.1.3.1項(xiàng)下的色譜條件，自動(dòng)進(jìn)樣 4、8、12、16、20 μL，分別記錄色譜峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為:柚皮苷:Y=32.24X－0.157 2，r=0.999 9，新橙皮苷:Y=38.872X+0.046 8，r=0.999 9。結(jié)果表明柚皮苷在 0.316 4 μg ～1.582 4 μg 范圍內(nèi)，新橙皮苷 0.188 0 μg～0.940 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品混合溶液10 μL，注入色譜儀，在相同的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，以柚皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品的峰面積計(jì)算，兩者的RSD分別為2.28%，2.90%。結(jié)果表明精密度良好。

2.1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取枳殼藥材粉末(40目)0.5 g，6份，精密稱定，分別按2.1.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行測(cè)定，供試品柚皮苷和新橙皮苷含量的RSD分別為0.61%，1.36%。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取枳殼藥材粉末(40目)0.5 g，按2.1.3.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、1、2、4、5 d 進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算柚皮苷和新橙皮苷色譜峰面積的RSD分別1.02%，2.00%，表明120 h內(nèi)供試品穩(wěn)定性良好。

2.1.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知柚皮苷和新橙皮苷含量的枳殼藥材6份，每份約0.25g，分別加入柚皮苷和新橙皮苷適量，按2.1.3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果柚皮苷回收率為99.17%，RSD=2.26%(n=6)、新橙皮苷回收率為96.11%，RSD=3.17%(n=6)。

2.1.3.9 樣品測(cè)定 取按正交設(shè)計(jì)表炮制的枳殼飲片按2.1.3.3項(xiàng)下操作制備樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，計(jì)算柚皮苷、新橙皮苷的含量。

2.1.4 性狀指標(biāo)測(cè)定 枳殼壓制后需經(jīng)發(fā)酵霉變并制成“鳳眼片”是樟幫枳殼的特色之一，霉變太過則影響外觀，不及則無法制成“鳳眼片”，故對(duì)樣品的霉變性狀和成型性進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2、表3。

表2 霉變性狀評(píng)分表

表3 外觀成型評(píng)分表

2.1.5 結(jié)果分析 以不同工藝的因素為自變量，柚皮苷含量、新橙皮苷含量、成型性和霉變性狀的標(biāo)準(zhǔn)化值為評(píng)判指標(biāo)，用13.0版SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性和方差分析，結(jié)果見表4至表6。

表4 方差分析表(n=64)

表5 相關(guān)性分析表(n=64)

表6 變量分析表(n=64)

表4顯示在炮制工藝中，溫度、時(shí)間、濕度對(duì)工藝有顯著影響，影響程度依次是溫度＞時(shí)間＞濕度。以標(biāo)準(zhǔn)化值最高為優(yōu)(表6)，最佳溫度為28℃，最佳濕度為92%，最佳時(shí)間確定:柚皮苷最佳為5 d，其次是3 d，新橙皮苷最佳為5 d，其次為3 d，成型最佳為5 d，霉變最佳為4 d，時(shí)間從分值來看應(yīng)是5 d最佳，但考慮到5 d時(shí)間過長(zhǎng)，大生產(chǎn)時(shí)影響生產(chǎn)效率，且時(shí)間與柚皮苷、新橙皮苷之間不存在明顯相關(guān)(表5)，此外，在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)在溫度28℃、相對(duì)濕度92%、時(shí)間為3 d時(shí)成型性和霉變性狀均很好，5 d時(shí)飲片易發(fā)黑，發(fā)綠，影響外觀，故最佳時(shí)間選擇3 d。綜合分析，樟幫枳殼的最佳工藝為A4B2C3，即溫度28℃，時(shí)間3 d，相對(duì)濕度92%時(shí)工藝為佳。

2.1.6 工藝驗(yàn)證 另取枳殼進(jìn)行了3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(結(jié)果見表7)。說明正交設(shè)計(jì)篩選出工藝可行。

表7 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表

2.2 樟幫枳殼炮制品工藝研究

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以樟幫麩炒枳殼工藝為基礎(chǔ)，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)的情況，采用L16(45)正交表對(duì)炮制溫度、炮制時(shí)間、麥麩用量三因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每因素設(shè)計(jì)四個(gè)水平，因素水平表見表8。

表8 因素水平表

2.2.2 樟幫枳殼炮制品制備 取樟幫枳殼飲片生品，依照正交設(shè)計(jì)表L16(45)進(jìn)行飲片炮制。

2.2.3 柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定 方法與2.1.3項(xiàng)下同，進(jìn)行柚皮苷、新橙皮苷的含量測(cè)定。

2.2.4 色度差測(cè)定 取按正交設(shè)計(jì)表炮制的枳殼飲片5～10片，在CIE規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)光源條件下獲取各批飲片外觀的色澤信息(照片文件)。用Adobe Photoshop 9.0分別讀入各批飲片外觀的色澤信息數(shù)據(jù)(照片文件)，讀取飲片的色澤指標(biāo)數(shù)據(jù) L、a、b值。用色差公式CIEDE 2000計(jì)算各批次飲片的色度差。

2.2.5 結(jié)果分析 以不同工藝的因素為自變量，柚皮苷含量、新橙皮苷含量標(biāo)準(zhǔn)化值飲片色度差為評(píng)判指標(biāo)，用13.0版SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性和方差分析，結(jié)果見表9至表11。

表9 方差分析表(n=32)

表10 相關(guān)性分析表(n=32)

由表9方差分析表明:A因素、B因素、C因素各水平之間差異具有顯著性(P＜0.05)。表10相關(guān)分析表明溫度與柚皮苷含量存在顯著負(fù)相關(guān)。以含量測(cè)定指標(biāo)最高優(yōu)，色度差最低優(yōu)為指標(biāo)(表11)，最佳溫度以200℃為最佳，最佳時(shí)間以120 s為最佳，麥麩用量:柚皮苷最佳依次為10% ＞25%＞15% ＞20%，新橙皮苷最佳依次為10% ＞25% ＞15% ＞20%，色度差最佳依次為20% ＞25% ＞15%＞10%，考慮到麥麩用量為10%時(shí)飲片的色度差最大，故選麥麩用量以25%最佳。綜合考慮，麩炒樟幫枳殼的最佳工藝為A3B4C4。即炮制溫度為200℃，麥麩用量為25%，炮制時(shí)間為120 s。

表11 變量分析表(n=32)

2.2.6 工藝驗(yàn)證 另取飲片照優(yōu)化工藝進(jìn)行了10批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(結(jié)果見表12)，說明篩選出的工藝可行。

表12 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表

2.3 小結(jié) 枳殼苦、辛、酸，微寒。入脾、胃經(jīng)。生用作用較猛，經(jīng)麩炒后，減低其刺激性，從而緩和其燥性和酸性，增強(qiáng)其健胃消脹的作用［3］。研究表明，枳殼中所含的柚皮苷和新橙皮苷為其主要活性成分［4］，《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定以高效液相法測(cè)定柚皮苷和新橙皮苷的含量作為枳殼藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)［1］。因此本實(shí)驗(yàn)在用正交設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)時(shí)，選擇柚皮苷和新橙皮苷的含量為考察指標(biāo)，此外，在樟幫生品制備工藝研究時(shí)綜合考查了霉變性狀與成型性，在樟幫麩炒制備工藝研究時(shí)將色澤用色度差進(jìn)行量化，使指標(biāo)更直觀準(zhǔn)確，能較好的考察和控制炮制條件，使所確定的最佳工藝更具有實(shí)用價(jià)值。

目前對(duì)樟幫枳殼的研究，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道主要是對(duì)其炮制前后的揮發(fā)油及成分變化的研究［5－10］，尚未見對(duì)樟幫枳殼生品工藝研究的報(bào)道?，F(xiàn)采用柚皮苷的含量、新橙皮苷含量、成型性等為考核指標(biāo)，依照正交設(shè)計(jì)表L16(45)進(jìn)行工藝優(yōu)選，確定樟幫枳殼生品的最佳工藝為:取去內(nèi)瓤的枳殼，洗凈，潤(rùn)12 h，壓扁后上木架，置溫度28℃，相對(duì)濕度92%的環(huán)境中培養(yǎng)3 d，取出，切薄片后干燥。

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