SPE-HPLC法測(cè)定胃腸寧片中3種生物堿的含量

丘明明， 黃玉華

(廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧 530021)

胃腸寧片是在胃腸寧沖劑的基礎(chǔ)上改進(jìn)為片劑，由布渣葉、辣蓼 、番石榴葉、火炭母、功勞木等五味中藥經(jīng)提取加工精制而成，有清熱祛濕，健胃止瀉功效;用于急性腸胃炎，小兒消化不良。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》［1］，無(wú)含量測(cè)定。處方中功勞木所含有的小檗堿原型生物堿為鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿［2］，目前此類成分都是用甲醇或鹽酸－甲醇提取，用中性氧化鋁柱進(jìn)行純化，再用 HPLC 法進(jìn)行含量測(cè)定［3－11］。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該制劑經(jīng)提取純化后色譜圖雜質(zhì)峰仍較多，干擾成分峰的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)，有效地除去雜質(zhì)干擾，用HPLC同時(shí)測(cè)定胃腸寧片中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿3種生物堿的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，可作為該制劑質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(含DAD檢測(cè)器)，MILLI—Q純水發(fā)生器;梅特勒電子天平;Waters公司W(wǎng)CX型弱陽(yáng)離子交換SPE小柱(60 mg/3 mL);鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713－200910，供含量測(cè)定用，以97.9%計(jì))、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào):110732－200506，供含量測(cè)定用)和鹽酸藥根堿對(duì)照品(批號(hào):0733－200005，供鑒別用，經(jīng)HPLC法分析，以面積歸一化法計(jì)算純度為:98.1%)均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;胃腸寧片(由廣西靈峰藥業(yè)有限公司提供，批號(hào):080701、081001、091001);陰性對(duì)照樣品(按照胃腸寧片制備工藝的方法制備缺功勞木的陰性樣品，由廣西靈峰藥業(yè)有限公司提供)。乙腈為色譜純?cè)噭?，水為高純水，其它試劑均為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

圖1 陰性樣品、對(duì)照品、樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of negative samples，reference substances and sample

2.1 色譜條件 色譜柱:Hvydro－RP 80A C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈－0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)pH2.8)(27:73);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取鹽酸藥根堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀對(duì)照品和鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL各含0.5 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%磷酸甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用25%磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，揮去甲醇，加于WCX型弱陽(yáng)離子交換小柱(預(yù)先依次用甲醇1 mL、水1 mL活化)上，流速約每分鐘1 mL，依次用水6 mL、25 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5)1 mL洗滌，棄去洗液，抽干1 min，繼用甲醇3 mL洗滌，棄去洗液，再用5%甲酸甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)芗尤爰状? mL使溶解，搖勻，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 取陰性對(duì)照樣品適量，按2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，制得陰性樣品溶液。

2.5 干擾試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件記錄色譜圖，鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿各峰的保留時(shí)間分別為9、15、17 min左右，均與鄰近峰達(dá)到基線分離，分離度良好(R＞1.5)，陰性對(duì)照樣品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見圖1。

2.6 線性范圍的考察 精密稱取鹽酸藥根堿對(duì)照品10.97 mg(純度:98.1%)，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密稱取鹽酸巴馬汀對(duì)照品11.53 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品10.05 mg(純度:97.9%)，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取3 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密量取上述 3 種貯備液 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，鹽酸藥根堿回歸方程為:Y=3.890 7X+0.504 2，r=1.000 0;鹽酸巴馬汀回歸方程為:Y=3.749 6X－0.748 0，r=1.000 0;鹽酸小檗堿回歸方程為:Y=3.905 6X－0.870 0，r=0.999 7。結(jié)果表明鹽酸藥根堿在3.443 7～6.887 4 ng;鹽酸巴馬汀在2.306～23.060 ng及鹽酸小檗堿在2.361 3～23.613 5 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(091001批)，按2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿RSD分別為0.64%、0.69%、0.76%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(091001批)，分別于 0、2、4、8、12、18、24 h，按 2.1 項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定7次，記錄色譜峰面積，結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿RSD分別為0.47%、0.90%、0.76%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(091001批)6份，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量分別為0.070 73 mg/g、0.055 60 mg/g、0.048 06 mg/g，RSD 分別為 1.17%、0.91%、0.33%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(091001批)，共9份，每份約0.25 g，平均分成3組，分別精密加入一定量的鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對(duì)照品，按2.3項(xiàng)方法操作，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Test results of recovery test

2.11 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的樣品，按2.3項(xiàng)下 方法制成供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination results of samples(n=3)

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇 用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)樣品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果鹽酸藥根堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀對(duì)照品、鹽酸小檗堿對(duì)照品分別在265 nm、266 nm和265 nm處有最大吸收，樣品峰與對(duì)照品一致，故測(cè)定波長(zhǎng)定為265 nm。

3.2 色譜柱的選擇 比較Hvydro－RP 80A C18、Kromasil C18和CAPCELLPAK MGII C183種不同品牌的色譜柱，結(jié)果所測(cè)成分峰形良好，且與其它成分峰達(dá)到基線分離。

3.3 提取條件的選擇 (1)比較鹽酸－甲醇和磷酸－甲醇溶液提取樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取液經(jīng)過(guò)固相萃取小柱后，前者被測(cè)成分不被吸附劑吸附，隨著雜質(zhì)流出，而后者被測(cè)成分被吸附劑牢牢吸附，與雜質(zhì)有效分離。(2)比較15%、20%、25%、30%的磷酸甲醇溶液提取樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用25%磷酸甲醇溶液提取的含量最高。(3)比較超聲處理時(shí)間15、30、60 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min即能將被測(cè)成分提取完全。(4)比較用25%磷酸甲醇溶液15、20、25、50 mL提取樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用25 mL即能將被測(cè)成分提取完全。

3.4 固相萃取柱的選擇 鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿都是季銨堿，實(shí)驗(yàn)中比較了MCX強(qiáng)陽(yáng)離子交換和WCX弱陽(yáng)離子交換SPE小柱，這兩種SPE小柱對(duì)堿性化合物都有強(qiáng)性的保留，能使堿性化合物從酸性和中性雜質(zhì)中分離出來(lái)，但強(qiáng)堿如季銨堿類會(huì)不可逆的保留在強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱上，而弱陽(yáng)離子交換作用則可以洗脫它們，與強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱比較，弱陽(yáng)離子交換柱上的吸附劑的pKa適用范圍更廣，從而使洗脫條件的靈活性更大。故選擇WCX弱陽(yáng)離子交換SPE小柱。

3.5 SPE洗脫條件的優(yōu)化 首先考察上樣體積(0.5、1.0、2.0、3.0 mL)，由于樣品中含雜質(zhì)較多，發(fā)現(xiàn)上樣體積3.0 mL時(shí)，溶液無(wú)法流出柱子，試驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行，說(shuō)明3.0 mL已經(jīng)超載。為了確保SPE能處于有效吸附狀態(tài)，確定過(guò)柱體積為1 mL。其次考察洗脫雜質(zhì)的溶劑水和甲醇的體積(4、5、6、7、8 mL 和1、2、3、4、5 mL)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用水6 mL 和甲醇3 mL，就能有效地除去雜質(zhì)。最后考察洗脫被測(cè)成分的溶劑5%甲酸甲醇溶液的體積(3、5、8、10 mL)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫溶劑3 mL～10 mL結(jié)果相差都不大，為了洗脫完全又不浪費(fèi)溶劑，故選擇洗脫溶劑體積為5 mL。

［1］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑［S］.第二冊(cè).1990:165.

［2］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(第三冊(cè))［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

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