高效液相二極管陣列檢測法同時測定丹參粉針劑中4種水溶性成分的含量

王 偉， 張 雪， 褚文靜， 杜秀芳， 許 祺， 黃喜茹

(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北石家莊 050017)

丹參粉針劑是由中藥丹參加工制成，具有擴張血管、增加血流量、通脈養(yǎng)心、活血化瘀的功效，臨床用于心絞痛、冠心病等疾病的治療［1］。丹參中的活性成分為脂溶性二萜醌類化合物和水溶性酚酸類化合物，而該制劑中的藥效成分是水溶性酚酸類化合物，包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、咖啡酸、異阿魏酸、紫草酸、鼠尾草列醇和丹酚酸 A、B、C、D、E、F、G 等［2］。前4 種成分含量較高，是該制劑的主要藥效成分。用反相高效液相色譜法測定其中原兒茶醛和丹參素的含量已見報道［3－4］，此法只用 2 種藥效成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)，不能綜合評價藥品的內(nèi)在質(zhì)量。用比色法測定此制劑或測定丹參有關(guān)制劑中水溶性酚酸總量的質(zhì)量分析方法已有多篇報道［5－7］，這些方法雖操作簡單，但專屬性差。本試驗建立高效液相二極管陣列檢測法同時測定丹參粉針劑中4種主要水溶性成分丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸的含量，為綜合評價該制劑的內(nèi)在質(zhì)量提供一種分析方法［8－10］。

1 儀器、樣品與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器、柱溫箱、四元泵、自動控溫進(jìn)樣器)。Agilent化學(xué)工作站。JA1203A型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。TCQ－250超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。

丹參素鈉(批號110855－200405)、原兒茶酸(批號 110809－200503)、原 兒 茶 醛 (批 號 110810－200506)對照品，均由中國藥品生物制品檢定所提供，迷迭香酸對照品，購自四川成都曼思特生物科技有限公司，純度98%以上。丹參粉針劑為市售品(批號 080410、06042201、07030202)。冰醋酸為分析純，甲醇為進(jìn)口色譜純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:DiamonsilTM(鉆石)C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇(A)－5%冰醋酸(B)，梯度洗脫。洗脫程序 A:0～7 min，30%;7～10 min，線性改變至 50%，10～25 min，50%(A+B=100%)。停止時間25 min，后運行10 min。柱溫為30℃，流速:1.0 mL/min，檢測波長:298 nm，進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下，理論塔板數(shù)按丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸計算均大于6 000。4組分均達(dá)到基線分離(R＞1.5)，其色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取丹參粉針劑62.22 mg置50 mL量瓶中，用20%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取得續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸對照品適量，置于25 mL量瓶中，用20%甲醇稀釋至刻度，配制成濃度分別為 109.6，148.4，35.08 μg/mL 和 129.6 μg/mL的對照品貯備液。

圖1 對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖1.丹參素 2.原兒茶酸 3.原兒茶醛 4.迷迭香酸Fig.1 Chromatogram of reference substances(A)and sample(B)1.danshensu 2.protocatechuic aicd 3.protocatechuic aldehyde 4.rosmarinic acid

分別精密吸取上述丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸貯備液3、0.1、0.5和0.3 mL置于10 mL量瓶中，用20%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為 32.88、1.484、1.754、3.888 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 取混合對照品溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾后，按以上色譜條件分別進(jìn)樣5、10、20、30、40、50、60、70、80 μL，記錄色譜峰面積，以峰面積A對進(jìn)樣量C(μg)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果:丹參素的線性方程為A=42.499C－0.437 8，r=0.999 9，線性范圍為 0.164 4 ～2.630 μg;原兒茶酸的線性方程為A=1 836.8C－0.843 8，r=1.000，線性范圍為0.007 420～0.118 7 μg;原兒茶醛的線性方程為A=2 512.5C－0.461 9，r=1.000，線性范圍為0.008 770～0.140 3 μg;迷迭香酸的線性方程為A=577.19C+0.043 8，r=1.000，線性范圍0.019 44 ～0.311 0 μg。

2.5 精密度和穩(wěn)定性試驗 按照上述色譜條件，取線性關(guān)系項下對照品溶液，各取20 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸的峰面積RSD分別為0.45%、0.16%、0.074%和0.094%。取同一供試品溶液，分別在 2、4、6、8、10、12、14 h 進(jìn)樣 20 μL，記錄峰面積，結(jié)果丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸的峰面積 RSD分別為0.16%、0.50%、0.051%和0.16%。

2.6 最低檢測限 取混合對照品溶液逐步稀釋后，注入高效液相色譜儀，以峰高為基線噪音3倍計，丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸的最低檢測濃度分別為 38、0.80、0.63、1.8 μg/mL。

2.7 重復(fù)性試驗 取批號為080410的丹參粉針劑，按照2.2項下方法制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，測得丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸的平均含量分別為213.5 mg/g(RSD=0.13%)，1.278 mg/g(RSD 為 0.67%)，8.451 mg/g(RSD為0.32%)和10.49 mg/g(RSD為0.15%)。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品溶液(080410)3份，分別加入一定量的混合對照品溶液，按照上述色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1回收率測定結(jié)果Tab.1 Determination results of recovery(n=3)

2.9 樣品測定 取3個批號丹參粉針劑，按照2.2項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定，用外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表2。

表2樣品測定結(jié)果Tab.2 Determination results of samples(n=5)

3 討論

經(jīng)二極管陣列檢測器對4種成分進(jìn)行全波長掃描，丹參素和原兒茶醛的最大吸收波長為281 nm，原兒茶酸的最大吸收峰波長為260 nm，次強吸收峰波長為298 nm，迷迭香酸的最大吸收波長為330 nm。為兼顧4種成分的檢測靈敏度，本試驗考察了采用不同檢測波長時檢出的信號強度，結(jié)果在298 nm各組分信號較強，且基線穩(wěn)定，因此采用298 nm為檢測波長。

從樣品測定結(jié)果看，不同廠家，不同批號的丹參粉針劑中4種水溶性酚酸類成分的含量有一定差異，其主要原因是原料丹參的品質(zhì)受產(chǎn)地、生長期、加工、提取條件等因素的影響。本試驗建立高效液相二極管陣列檢測法同時測定丹參粉針劑中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和迷迭香酸4種有效成分的含量，此法可更全面評價該藥品的質(zhì)量。

［1］鄭虎占.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用［M］.第二卷.北京:學(xué)苑出版社，1997:1099.

［2］張英鋒，王燕革，馬子川，等.丹參活性化學(xué)成分的研究［J］.化學(xué)世界，2009，10:638－640.

［3］戴 忠，錢忠直.HPLC法測定丹參粉針劑中丹參素及原兒茶醛含量［J］.中成藥，1996，18(6):10－11.

［4］關(guān)大衛(wèi).HPLC法測定注射用丹參粉針中丹參素的含量［J］.藥物分析雜志，1994，14(3):36－37.

［5］黃喜茹，曹 冬，樊淑彥，等.NaNO2－Al(NO3)3顯色測定丹參及其制劑中水溶性酚酸總量［J］.化學(xué)試劑，2005，27(12):745－746.

［6］李廣勝，王光新，趙牛和.丹參口服液中總酚酸性成分的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2001，12(8):683.

［7］王勝春，蔣永培，迂蘇寧，等.五靈丸中丹參總酚性成分的測定［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1993，14(5):386.

［8］張 燁，鄭 穎，王一濤.應(yīng)用改進(jìn)的質(zhì)量評價方法考察復(fù)方丹參制劑［J］.中成藥，2009，31(12):1855－1860.

［9］呂文海，王 姣，張力中，等.山東丹參飲片產(chǎn)地加工方法與質(zhì)量分析［J］.中成藥，2004，26(8):637.

［10］褚文靜，張 雪，黃喜茹，等.RP－HPLC法測定濕毒清片中7種活性成分［J］.中草藥，2010，41(11):1809－1811.