急性子中黃酮類成分HPLC指紋圖譜的初步研究

王 巍， 鞠成國， 朱 旭， 趙煥君

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600;2.沈陽南六成大方圓醫(yī)藥有限公司，遼寧沈陽 110005)

急性子為鳳仙花科植物鳳仙花Impatiens balsaminaL.的干燥成熟種子［1］，始載于《救荒本草》，具有破血軟堅，消積的功效，用于治療癥瘕痞塊，經(jīng)閉，噎膈。據(jù)文獻報道急性子中含有黃酮類、皂苷類、脂肪油等化合物［2－7］，其中所含的黃酮類化合物具有多種生物活性，除抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有顯著效果［8］。本試驗采用HPLC法，建立急性子中黃酮類成分的指紋圖譜［9－11］，并對 11 個不同產(chǎn)地藥材的相似性進行分析。

1 儀器與材料

電子天平(FA1004B)，超聲波清洗器(SB5200D)，紫外－可見分光光度計(日立U3010)，高效液相色譜儀(Agilent 1100系列);槲皮素(100080－200406)、山 柰 酚 (0861－200002)、蘆 丁(100080200306)購自中國藥品生物制品檢定所;急性子藥材分別于2008年11月收集于江蘇無錫(S1)、安徽六安(S2)、福建三明(S3)、遼寧撫順(S4)、安徽亳州(S5)、河北安國(S6)、河南鄭州(S7)、遼寧沈陽(S8)、蘇州太湖(S9)、云南昆明(S10)、浙江杭州(S11)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為鳳仙花科植物鳳仙花Impatiens balsaminaL.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil TM C18柱(250 mm ×4.6mm，5 μm);流動相:甲醇(A)－0.4%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0 min:35%A;15 min:45%A;30 min:60%A;45 min:75%A;50 min:100%A);檢測波長:365 nm;柱溫:30℃;流速:1.0 ml/min。

2.2 供試品溶液制備 取急性子藥材炒黃，破碎，取粉末5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中;加入乙醚30 mL，超聲處理20 min，棄去乙醚液，水浴揮散乙醚至藥渣無醚味;精密加入70%甲醇40 mL，稱重，超聲處理40 min，取出，放涼，稱重(必要時補足所失重量)，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，濾液備用。

2.3 對照品溶液制備 分別精密稱取槲皮素、山柰酚和蘆丁對照品適量，加甲醇制成濃度為0.005 56 mg/mL、0.002 42 mg/mL 和 0.017 2 mg/mL 的溶液，備用。

2.4 測定方法 分別精密吸取不同產(chǎn)地供試品溶液及對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的確定 以槲皮素色譜峰為參照，確定其相對保留時間為1，計算其它色譜峰的相對保留時間，標(biāo)定出12個共有峰，結(jié)果見表1。指紋圖譜見圖1。經(jīng)與對照品相比較，確定9號共有峰為蘆丁，12號共有峰為山柰酚。11個不同產(chǎn)地急性子藥材指紋圖譜疊圖見圖2。

表1共有峰的相對保留時間Tab.1 Relative retention time of common peaks

圖1 急性子藥材HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Impatientis Semen

2.5.2 共有峰相對峰面積 以槲皮素色譜峰面積作為1，計算其它各共有峰的相對峰面積。結(jié)果不同樣品共有峰相對峰面積差異較大，表明不同地區(qū)的急性子藥材質(zhì)量之間存在較大差別。結(jié)果見表2。

2.5.3 共有峰面積 對11個不同產(chǎn)地藥材的色譜峰面積進行統(tǒng)計，計算各自共有峰面積占總峰面積的百分比，結(jié)果在90.3% ～94.8%之間，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的相關(guān)規(guī)定。結(jié)果見表3。

圖2 11個產(chǎn)地急性子藥材HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint for 11 different habitats of Impatientis Semen

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度考察 取同一份供試品溶液(S11)，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間RSD＜0.8%，相對峰面積RSD＜1.0%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

表2共有峰的相對峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks

表3 共有峰面積百分比Tab.3 Percentage of the common peak areas

2.6.2 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液(S11)，分別在 0、2、4、8、16、24 h 測定，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間RSD＜1.2%，相對峰面積RSD＜1.6%。結(jié)果表明，24 h內(nèi)測定，樣品穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性考察 取急性子藥材(S11)5份，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別進行測定。各共有峰的相對保留時間RSD＜1.1%，相對峰面積RSD＜2.0%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.7 相似度評價［12］采用平均矢量法對11個不同產(chǎn)地的急性子藥材指紋圖譜建立共有模式，作為對照指紋圖譜，將每張指紋圖譜與其進行比較，得到各譜與對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果見表4。試驗結(jié)果提示，S1～S5和S7～S11與對照圖譜的相似度均達到0.9以上，符合要求。S6和S7與對照圖譜的相似度為0.85，小于0.9，但由性狀鑒別無法否定其為急性子藥材，因此有待于進一步采用化學(xué)模式識別方法作進一步評價。

表4相似度考察Tab.4 Investigation of similarity

3 討論

3.1 提取溶劑考察 鑒于黃酮類成分在一定濃度的醇水中溶解度較大，因而本試驗擬采用甲醇為溶媒，分別對甲醇、70%甲醇、50%甲醇的提取情況進行考察。試驗結(jié)果提示，甲醇提取的樣品色譜圖中，色譜峰個數(shù)較少，峰面積小，表明提取效率較低，可能因為急性子中黃酮類成分主要以苷的形式存在;70%甲醇提取的樣品色譜圖中，色譜峰個數(shù)較多，峰面積較大;50%甲醇提取的樣品色譜圖中，色譜峰較70%甲醇提取時峰面積小，靈敏度相對較低。因而確定70%甲醇為提取溶劑。

3.2 超聲提取時間考察 超聲提取操作簡單，提取效率高，適于對大量樣本的提取，因而本試驗采用超聲提取的方法制備供試品溶液，并對超聲提取時間進行考察。試驗結(jié)果提示，超聲提取40 min后，色譜峰數(shù)目及色譜峰面積基本穩(wěn)定。

3.3 色譜條件選擇考察

3.3.1 檢測波長的選擇 試驗中對槲皮素、山柰酚、蘆丁進行紫外全波長掃描，綜合它們最大吸收情況，分別在260 nm和365 nm下檢測。試驗結(jié)果提示，檢測波長為365 nm時的色譜峰數(shù)目明顯多于260 nm，并且靈敏度較高，因此確定365 nm為檢測波長。

3.3.2 流動相的選擇 試驗中分別對甲醇－水、甲醇－磷酸三乙胺水溶液、甲醇－0.4%磷酸水溶液不同梯度洗脫系統(tǒng)進行篩選。最后確定流動相為甲醇－0.4%磷酸水溶液，按前述系統(tǒng)梯度洗脫，各色譜峰分離較好。

4 結(jié)論

急性子藥材目前臨床應(yīng)用較少，但從文獻報道來看，其在治療食道癌方面確有獨到之處。由于《中國藥典》對急性子藥材尚無定性、定量檢查方法，本試驗采用HPLC法建立急性子中黃酮類成分指紋圖譜，旨在為急性子藥材的質(zhì)量控制提供試驗依據(jù)。試驗結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好，可操作性強，可用于對急性子藥材的定性鑒別。試驗中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)定的各共有峰相對色譜峰面積相差較大，考慮應(yīng)與藥材的生長環(huán)境有關(guān)，在臨床應(yīng)用中，為保證其療效的穩(wěn)定，應(yīng)對藥材的產(chǎn)地進行規(guī)定，這也是實行中藥GAP的意義所在。試驗中對部分指紋峰進行了歸屬，下一步會對其含量進行測定，建立急性子藥材中黃酮類成分的質(zhì)量控制方法，而該類成分與療效的關(guān)系則有待于進一步的研究。

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