HPLC－紫外法測(cè)定人血漿中舒芬太尼濃度

吳巧玲，王玲玲，馬虹，王俊科

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110001）

舒芬太尼是目前心血管手術(shù)麻醉的首選藥物之一。為更好的指導(dǎo)臨床用藥，有必要對(duì)血漿中舒芬太尼濃度進(jìn)行動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)。但由于其用量小、血藥濃度低，故對(duì)檢測(cè)儀器和方法的靈敏度要求高。本研究建立了一種血漿微量舒芬太尼濃度的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定方法，具有檢測(cè)限低、線性好、靈敏度和精確度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于血藥濃度監(jiān)測(cè)及藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（Waters-600泵，Waters-2487紫外檢測(cè)儀，Waters脫氣機(jī)）；AR1140電子天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；MVS-1旋渦混合器（北京金化德工貿(mào)有限公司）；TG16-WS離心沉淀器（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品、芬太尼對(duì)照品（湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；色譜純乙腈（山東禹王）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉（沈陽(yáng)試劑一廠）；正己烷、無(wú)水乙醇、磷酸（北京化工）；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×200 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈∶0.015 mol/L KH2PO4緩沖液（31∶69，V/V，pH=3.0）；室溫下測(cè)定，流速1.0 mL/min，按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)200 nm，進(jìn)樣量 50 μL，靈敏度：0.002 AUFS。

1.2.2 舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)液的配制：精密稱取枸櫞酸舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成100μg/mL的母液，依次稀釋成5 000，2 000，1 000，500，200，100，50，20 ng/mL 系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液，待用。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取100μg芬太尼，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，即得10 μg/mL內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液，用重蒸水將其稀釋至500 ng/mL，4℃冷藏保存，備用。

1.2.4 血樣處理：精取血漿樣本200μL，加入500 ng/mL的芬太尼20μL，旋渦混合10 s，再加入100 μL的2 mol/mL NaOH，旋渦混合10 s。最后加入2 mL 正己烷－無(wú)水乙醇（19∶1，V/V），渦旋 5 min，3 500 g離心10 min，靜置10 min后，移取上清液于5 mL玻璃試管中，于35℃水浴上用氮?dú)獯蹈?。?00μL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋混合3 min，移至離心管中，1.2×104g離心5 min，取上清液50μL進(jìn)樣。

1.2.5 血漿舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精取空白血漿180μl，分別精密加入20μL舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度，使成 500，200，100，50，20，10，5，2 ng/mL 的含藥血漿，每種濃度分別配置3份，渦旋混合10 s。其余步驟同1.2.4。樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，樣品濃度（x）為橫坐標(biāo)，以 1/x2為權(quán)重，作線性回歸。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為

空白血漿色譜圖相應(yīng)4~10 min處無(wú)峰出現(xiàn)，基線平穩(wěn)，血中物質(zhì)對(duì)舒芬太尼的分離無(wú)干擾，舒芬太尼保留時(shí)間為9.558 min，其內(nèi)標(biāo)芬太尼的保留時(shí)間為 4.765 min，見(jiàn)圖 1。

2.2 舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品曲線

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 The high performance liquid chromatogram

分別吸取含有 500，200，100，50，20，10，5，2ng/mL舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液的血漿各50μL進(jìn)樣，以樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，作線性回歸。求得舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程 y=0.002 1+0.004 4x，r=0.999 6。

2.3 提取回收率

將不同血漿濃度舒芬太尼的峰面積代入血漿標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計(jì)算得濃度值C1；代入未經(jīng)處理的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計(jì)算得濃度值C2；C1/C2即為提取回收率。濃度為2，50，500 ng/mL血漿樣品的平均提取回收率見(jiàn)表1。

表1 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）Tab.1 Results of the extraction recovery test（x±s，n=5）

2.4 方法回收率

根據(jù)血漿標(biāo)準(zhǔn)品曲線測(cè)得濃度與實(shí)際濃度之比即為方法回收率。濃度為2，50，500 ng/mL血漿樣品的平均方法回收率見(jiàn)表2。

2.5 精密度

配制舒芬太尼濃度分別為2，50，500 ng/mL的血漿樣品，分別于1 d內(nèi)進(jìn)行5次提取進(jìn)樣及5 d內(nèi)5次提取進(jìn)樣，計(jì)算日內(nèi)變異（relativestandard deviation，RSD）和日間變異RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

舒芬太尼作為一種阿片類強(qiáng)效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，具有安全、快速、心血管作用穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是目前心血管手術(shù)麻醉的首選藥物之一。近年來(lái)，隨著靜脈麻醉和術(shù)后鎮(zhèn)痛成為臨床麻醉學(xué)發(fā)展的兩個(gè)重要趨勢(shì)［1，2］，使舒芬太尼的臨床應(yīng)用日益廣泛。為更好的指導(dǎo)臨床用藥，有必要對(duì)血漿中舒芬太尼濃度進(jìn)行動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)。但是由于其用量小、血藥濃度低，故對(duì)檢測(cè)儀器和方法的靈敏度要求高。目前國(guó)內(nèi)外有報(bào)道利用液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法［3，4］以及氣相色譜法測(cè)定血漿中舒芬太尼的濃度，但是這些方法檢測(cè)費(fèi)用高，不能夠廣泛應(yīng)用。本研究建立了一種血漿微量舒芬太尼濃度的HPLC測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)限低、線性好、靈敏度和精確度高的優(yōu)點(diǎn)，且能夠滿足人體血漿中藥物濃度的測(cè)量。

表2 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）Tab.2 Results of the method recovery test（x±s，n=5）

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）Tab.3 Results of the precision test（x±s，n=5）

準(zhǔn)確測(cè)定血漿中微量舒芬太尼含量的關(guān)鍵在于盡量避免各種物質(zhì)對(duì)色譜圖形的可能干擾。本研究中正己烷選用了色譜純，能夠更好的減少對(duì)基線的干擾，使基線更穩(wěn)；為了提高回收率，減少正己烷對(duì)塑料物質(zhì)的腐蝕，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)避免用塑料試管；振蕩時(shí)，采用減小振蕩強(qiáng)度，延長(zhǎng)振蕩時(shí)間的措施［5］，盡可能減少乳化現(xiàn)象的發(fā)生，從而有效地提高了萃取率。

綜上所述，本研究建立的血漿微量舒芬太尼濃度的HPLC測(cè)定方法適用于血藥濃度監(jiān)測(cè)及對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的研究，為臨床上進(jìn)行血漿中藥物濃度檢測(cè)提供了良好的方法。

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