HCV NS5A結(jié)合蛋白順烏頭酸酶1的驗證研究

王曉杰，相久全，韓樂強，張錦前*，成 軍

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京100015;2密云縣第二醫(yī)院;3大連市第六人民醫(yī)院)

HCV與肝臟脂肪變性、糖代謝異常、2型糖尿病等代謝類疾病密切相關(guān)［1］，肝臟脂肪變性與慢性丙型肝炎(CHC)疾病進展也有關(guān)［2，3］。近年研究發(fā)現(xiàn)HCV NS5A可能是肝臟脂肪變性及HCC發(fā)生發(fā)展的間接機制［4］。2009年9月～2010年9月，我們應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選肝臟cDNA文庫中HCV NS5A的結(jié)合蛋白，并對這些蛋白的相互作用進行實驗驗證，為HCV影響糖、脂類代謝的分子生物學(xué)機制研究提供實驗室依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系 HepG2、pGBKT7-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-myc-his、pBIND-HCV NS5A、載 體 由 本室 保 存。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;酵母雙雜交所需各種培養(yǎng)基均購自美國Clontech公司;anti-HCV NS5A及anti-his單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、哺乳動物雙雜交試劑盒(包括實驗所需質(zhì)粒)、Dual-Luciferase?雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，引物合成及DNA測序由北京奧科生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pGBKT7-HCV NS5A轉(zhuǎn)化酵母菌株并進行鑒定 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HCV NS5A由本所構(gòu)建保存，將前述質(zhì)粒用醋酸鋰法轉(zhuǎn)導(dǎo)入酵母菌株AH109，隨后鋪平板(SD/-Trp培養(yǎng)基)，隨機挑取直徑＞2 mm的菌落PCR鑒定。

1.2.2 酵母菌株Y187(肝細(xì)胞cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)與酵母菌株AH109(pGBKT7-HCV NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)配合 前述鑒定正確的AH109酵母接種于一缺培養(yǎng)基中，30℃振搖至A600為0.8～1.0后重懸于50 ml 2×YPDA培養(yǎng)基中，與4 ml含肝細(xì)胞cDNA文庫的酵母細(xì)胞于搖床中30℃輕微振搖培養(yǎng)配合48 h。顯微鏡下觀察到三葉草二倍體細(xì)胞后，離心將其酵母菌重懸于0.25×YPDA培養(yǎng)基，鋪三缺及四缺培養(yǎng)板各50塊，于孵箱中以30℃培養(yǎng)16 d后，再把直徑＞2 mm的菌落于鋪有X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上劃線，生長且呈藍(lán)色的為二者蛋白結(jié)合的所篩選陽性的克隆。

1.2.3 陽性質(zhì)粒的分析 在四缺培養(yǎng)基上挑取前述陽性克隆，于搖床中30℃劇烈振搖培養(yǎng)5 d后離心，提取酵母菌的質(zhì)粒，電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，隨后于含氨芐LB平板上培養(yǎng)。再提取前述菌落質(zhì)粒，進行酶切鑒定，認(rèn)定正確后測序。測序結(jié)果與PUMED中的已知基因序列比對分析。

1.2.4 構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-3.1(-)-mychis-aconitase1 根據(jù)人順烏頭酸酶1(aconitase1)基因序列(Gene Bank accession:NM_002197.2)，在編碼區(qū)上游和下游設(shè)計合成一對引物(兩端分別引入XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切位點):(上游:5'-CTCGAGATGAGCAACCCATTCGCAC-3';下游:5'-AAGCTTCTTGGCCATCTTGCGGATC-3')。TRIzol法提取HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備成cDNA模板，隨后用前述引物進行PCR擴增，最終獲得aconitase1基因的全長序列。經(jīng)電泳鑒定后回收純化，產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鋪LB培養(yǎng)板37℃過夜。第2天挑取平板上單克隆菌再培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒行XhoⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確后測序。測序結(jié)果正確者再純化回收，與 XhoⅠ/HindⅢ雙酶切 pcDNA3.1-myc-his空載體連接，再行轉(zhuǎn)化鋪于LB/Amp固體平板，37℃過夜孵育后，提取質(zhì)粒DNA后以XhoⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每3 d傳代一次。轉(zhuǎn)染前2 d，以1×106細(xì)胞/孔密度接種培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒設(shè)為實驗組和陰性對照組，每孔轉(zhuǎn)染8 μg質(zhì)粒DNA。

1.2.6 免疫共沉淀(CO-IP) 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，提取各孔細(xì)胞的總蛋白，行CO-IP:細(xì)胞用PBS洗2次;各孔中加入冰預(yù)冷的非變性細(xì)胞裂解液(1%PMSF)完全裂解細(xì)胞;抽提細(xì)胞蛋白，收集上清;前述上清中加入Protein-G/A Beads，4℃搖床緩慢振搖4 h后離心收集上清;上清中再加入anti-his單抗后4℃緩慢振搖過夜;隨后EP管中再加入適量Protein-G/A Beads，此后再慢搖12 h;離心后棄上清;沉淀中加入5×SDS Buffer，煮沸15min;離心后收集上清。

1.2.7 SDS-PAGE及Western blot驗證CO-IP蛋白蛋白樣SDS-PAGE膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，質(zhì)粒pcDNA 3.1(-)HCV NS5A單轉(zhuǎn)染組、實驗組及陰性對照組各組使用同種單抗，即anti-HCV NS5A的單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜封閉。二抗使用HRP-IgG(1∶1 000稀釋)，搖床上室溫?fù)u1 h后，洗膜，壓片后再顯影及定影。

1.2.8 哺乳動物雙雜交(Mammalian Two-Hybrid)試驗 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)后接種于12孔板后再培養(yǎng)48 h。每孔2 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，共分如下各組:空細(xì)胞組;陰性對照組1(質(zhì)粒 pACT、pBIND、pG5Luc共轉(zhuǎn)染);陰性對照組2(質(zhì)粒 pACT-aconitase1、pBIND、pG5Luc共轉(zhuǎn)染);陰性對照組3(質(zhì)粒pACT、pBINDHCV NS5A、pG5Luc共轉(zhuǎn)染);陽性對照(pG5Luc、pACT-myoD、pBIND-Id共轉(zhuǎn)染);實驗組(質(zhì)粒pACT-aconitase1、pBIND-HCV NS5A、pG5Luc 共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，雙熒光素酶活性檢測，數(shù)據(jù)取兩種酶檢測值的比值(即Firefly Luciferase和Renilla Luciferase兩種熒光值)。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，全部數(shù)據(jù)以±s表示，比較多個樣本均數(shù)采用方差分析，多個樣本均數(shù)兩兩比較用SNK-q檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝臟cDNA文庫中HCV NS5A結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選 人肝臟cDNA文庫蛋白與HCV NS5A蛋白結(jié)合使相應(yīng)酵母配合，此時可在顯微鏡下觀察到三葉草狀二倍體細(xì)胞(圖1)。三缺和四缺培養(yǎng)基上生長出多個克隆，在鋪有X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上長出8個陽性克隆。篩選出的肝細(xì)胞cDNA文庫質(zhì)粒進行測序與同源性分析(根據(jù)PUMED數(shù)據(jù)庫)，發(fā)現(xiàn)其中兩個克隆為aconitase1。

2.2 Western blot結(jié)果 成功表達HCV NS5A(圖2)及aconitase1蛋白(圖3)(實驗重復(fù)3次，結(jié)果均一致)，并證實HCV NS5A與aconitase1蛋白在肝細(xì)胞HepG2內(nèi)存在相互作用(圖4)(實驗重復(fù)3次，結(jié)果均一致)。

2.3 Mammalian Two-Hybrid實驗結(jié)果 將各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h，檢測相對熒光素酶活性值。實驗組的相對熒光素酶活性值(0.012 8±0.001 2)高于陰性對照組1(0.003 3±0.000 5)、陰性對照組2(0.004 2±0.000 8)、陰性對照組3(0.004 7±0.001 2)，P均 ＜0.05。因此，本實驗證實 HCV NS5A與人aconitase1蛋白在肝細(xì)胞HepG2內(nèi)存在相互作用關(guān)系。

3 討論

有關(guān)慢性HCV感染多年的臨床流行病學(xué)及實驗研究資料表明，CHC常伴有糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病;CHC與這些代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［5］，肝臟脂肪變性及胰島素抵抗(IR)可能是HCV引發(fā)代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)，其分子生物機制是病毒導(dǎo)致的脂代謝紊亂。糖、脂代謝異常則加重IR，三者之間關(guān)系密切、互為因果、也可能相互促進，其中 IR 可能是中心環(huán)節(jié)［6，7］。

aconitase為三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕帷幟仕岜旧聿灰籽趸?，在aconitase作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。aconitase是為細(xì)胞提供能量的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞代謝方面也起關(guān)鍵作用。

本研究我們通過酵母雙雜交篩選出HCV NS5A在肝細(xì)胞內(nèi)與之可能存在相互作用的蛋白基因，并進一步通過體外細(xì)胞實驗(Mammalian Two-Hybrid及CO-IP實驗)證實了HCV NS5A與aconitase蛋白存在相互作用關(guān)系，為HCV感染合并2型糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的分子生物學(xué)機制的研究提供了一定的線索和研究思路。但HCV NS5A與aconitase蛋白的結(jié)合位點、結(jié)合方式，對aconitase功能以及進一步影響細(xì)胞代謝過程等一系列分子生物學(xué)機制尚未完全清楚，有待更為深入的研究。

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