脾酪氨酸激酶蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及意義

劉泓基，彭 艷，廖 玲，薄曉通，苗蘇州

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林 541001;2廣西師范大學(xué);3南京市第二人民醫(yī)院)

近年研究發(fā)現(xiàn)，脾酪氨酸激酶(Syk)表達(dá)缺失可能與乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽囊癌等形成和轉(zhuǎn)移有關(guān)，但鮮見 Syk蛋白在胃癌組織中表達(dá)的報道。2010年 9～12月，我們對 Syk蛋白與胃癌發(fā)生、發(fā)展及其惡性生物學(xué)行為的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)治療且資料保存完整的 38例胃癌患者的病灶切除組織標(biāo)本。其中，男 22例、女 16例，年齡 38～76歲，術(shù)前均未行放療、化療及生物制劑治療。根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟及美國腫瘤聯(lián)合會聯(lián)合制定的 TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，T1+T2期 16例、T3+T4期 22例。另隨機(jī)選擇癌旁組織(距瘤塊組織 5 cm以上)16例組織標(biāo)本作為對照。

1.2 方法 濃縮型一抗購自美國 BG公司(型號:P04S066785E)，即用型二抗試劑盒購自中杉金橋(美國 GBI公司，型號:PV-9005)檢測 Syk蛋白表達(dá)。蠟塊 4μm連續(xù)切片，53℃孵育 60 min，切片常規(guī)脫蠟和水化后，先用 PBS沖洗 3次 ×3 min，再用檸檬酸鈉加熱法對抗原進(jìn)行修復(fù)2 min。室溫下，切片置 3%過氧化氫中 10 min，PBS沖洗 3次;10%血清孵育 10 min，加一抗室溫下孵育 60 min，PBS沖洗3次 ×5 min;加中杉金橋二抗試劑按 1∶200稀釋孵育 10～15 min，PBS沖洗 3次;加新鮮配制二氨基聯(lián)苯溶液顯色，顯微鏡下觀察 1～3 min。自來水沖洗后加入蘇木素復(fù)染，再用 PBS沖洗返藍(lán)。切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、照相。每批染色均設(shè)陰性空白對照，以PBS代替一抗作陰性對照，用人 Burkitt淋巴瘤細(xì)胞作陽性對照。結(jié)果判斷:以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每例切片至少計數(shù) 10個 400倍視野，細(xì)胞數(shù)所占比例分為:＜10%(-)，10%～29%(+)，30%～50%(++)，＞50%(+++)。染色強(qiáng)度判定:不著色 (-)，淺棕黃色 (+)，棕黃色 (++)，棕褐色(+++)。綜合陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度對染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，計量資料比較采用 t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Syk蛋白在胃癌及癌旁組織的表達(dá)情況 胃癌及癌旁組織中 Syk蛋白陽性分別為 8例(21.05%)、14例(87.50%)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.59，P＜0.01)。

2.2 Syk蛋白在胃癌組織的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

3 討論

Syk基因最早由日本學(xué)者 1991年從豬脾 cDNA克隆出來的，該基因位于人類染色體 9q22，分子量72 kD，由 629個氨基酸組成。Syk是目前發(fā)現(xiàn)的唯一有抑癌作用的蛋白酪氨酸激酶。Coopman等首先發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中有 Syk表達(dá)缺失現(xiàn)象，此后大量研究表明，在多種腫瘤發(fā)病過程中存在 Syk表達(dá)缺失現(xiàn)象[1～4]。

表1 Syk蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

目前認(rèn)為 Syk可能通過以下機(jī)制影響腫瘤發(fā)生:影響細(xì)胞遷移;抑制細(xì)胞分裂和增殖;干預(yù)某些細(xì)胞因子的分泌;抑制腫瘤成瘤能力和轉(zhuǎn)移。胡青鋼等[5]發(fā)現(xiàn)，Syk的表達(dá)與胃癌的微血管密度呈明顯的負(fù)相關(guān)，提示 Syk作為一種候選抑癌基因，可能通過影響血管的生成而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Carter等[6]研究證實，Syk可通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。劉月仙等[7]研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織 Syk基因甲基化率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明 Syk基因的甲基化與胃癌生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn) Syk基因甲基化導(dǎo)致在胃癌中存在Syk基因失表達(dá)現(xiàn)象，表明 Syk啟動子甲基化與胃癌形成和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Syk基因在胃癌中的表達(dá)報道不一致，有文獻(xiàn)報道 Syk在胃癌中表達(dá)陽性率為 5.1%～41.2%，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。本研究表明，Syk蛋白在胃癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于正常癌旁組織(P＜0.01)，且在腫瘤組織中 Syk蛋白表達(dá)強(qiáng)度與漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系(P＜0.05)，而與年齡、性別、組織學(xué)類型無關(guān)。大量研究表明，Syk有抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的功能。在本課題的后續(xù)研究中，在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光定量 PCR和甲基化 PCR法在基因水平檢測 Syk表達(dá)與胃癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，并應(yīng)用 FISH檢測 Syk基因擴(kuò)增和基因突變情況，進(jìn)一步探索胃癌中 Syk失表達(dá)的機(jī)制，并聯(lián)合檢測 HER-2及 EGFR基因，從分子和細(xì)胞生物學(xué)角度探討多基因與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為進(jìn)一步尋找胃癌早期診斷的分子生物標(biāo)志及早期分子治療的靶標(biāo)提供實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

總之，Syk蛋白在胃癌組織中呈現(xiàn)明顯表達(dá)缺失，且與其漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向相關(guān)。Syk在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其防治中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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