胰島素改善糖尿病小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員障礙研究*

董莉，徐標(biāo)，康麗娜，丁亮，陳琴，高玲

血管內(nèi)皮功能異常、組織缺血后側(cè)支血管形成障礙是糖尿病患者易患血管閉塞性疾病的重要機(jī)制。近年來(lái)的研究顯示，缺血組織的血管新生及側(cè)支血管形成不僅依賴于成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，循環(huán)中骨髓起源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)也積極參與了這一過(guò)程。內(nèi)源性缺血損傷或者應(yīng)用細(xì)胞因子及藥物能夠動(dòng)員骨髓中的干細(xì)胞和EPC至外周血，進(jìn)而參與內(nèi)皮修復(fù)及血管新生［1，2］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及間充質(zhì)衍生因子1α(SDF-1α)/基質(zhì)金屬蛋白酶-9信號(hào)通路在EPC動(dòng)員過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3，4］。研究也發(fā)現(xiàn)糖尿病個(gè)體循環(huán)中EPC數(shù)量減少、治療性血管新生呈現(xiàn)反應(yīng)缺陷［5］。我們先前的研究顯示糖尿病患者及糖尿病動(dòng)物組織缺血后骨髓EPC向外周血?jiǎng)訂T明顯減少［6］，本研究的主要目的就是進(jìn)一步探討骨髓EPC動(dòng)員障礙的可能機(jī)制，并觀察胰島素治療能否改善這種障礙。

1 材料與方法

糖尿病模型的建立:2007-12至2009-05選取C57BL/6小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)8周齡，96只，體重(25.1±1.2)g。參照文獻(xiàn)［6］腹腔注射鏈脲霉素(美國(guó)sigma公司)建立糖尿病模型。隨機(jī)分為糖尿病組和糖尿病胰島素治療組(胰島素組)，胰島素組術(shù)前及術(shù)后注射胰島素以糾正高血糖［5］。另取非糖尿病組作對(duì)照(各組n=32)。

后肢缺血模型的建立:入組小鼠飼養(yǎng)2個(gè)月后，參照文獻(xiàn)［6］行左側(cè)股動(dòng)脈及其大分支結(jié)扎離斷術(shù)，術(shù)后通過(guò)血管造影及紅四氮唑(南京國(guó)藥集團(tuán))染色評(píng)估手術(shù)效果，確定單側(cè)后肢缺血模型造模成功。

骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞分離:于術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間(0、1、3、7 天)采血，利用 Histopaque-1083 密度梯度離心獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞。以外科手法暴露股骨及脛腓骨，定量沖洗骨髓，離心后分離上清及骨髓細(xì)胞。

外周血早期EPC檢測(cè):參照文獻(xiàn)［6］，重懸外周血單個(gè)核細(xì)胞，分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的大鼠抗小鼠干細(xì)胞抗原1(Sca-1)單克隆抗體、藻紅蛋白-花青苷5標(biāo)記的大鼠抗小鼠干細(xì)胞因子受體(c-Kit)單克隆抗體、藻紅蛋白標(biāo)記的大鼠抗小鼠胎肝激酶1(Flk-1)單克隆抗體3種小鼠早期EPC表面標(biāo)記抗體或同型對(duì)照(美國(guó)eBioscience公司)，4℃避光孵育，孵育結(jié)束后采用美國(guó)BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用 Cell Quest軟件分析外周血單個(gè)核細(xì)胞中c-Kit+/Sca-1+/Flk-1+細(xì)胞比例，代表外周血早期EPC水平。

血漿及骨髓VEGF、SDF-1α水平測(cè)定:酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿及骨髓中VEGF、SDF-1α水平，操作按照檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R＆D公司)說(shuō)明書進(jìn)行。

骨髓細(xì)胞VEGF、蛋白激酶B、內(nèi)皮型一氧化氮合酶及基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白及其磷酸化產(chǎn)物測(cè)定:參照文獻(xiàn)［7］，免疫印跡法測(cè)定骨髓細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)水平［羊抗小鼠 VEGF多克隆抗體1:400(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗小鼠蛋白激酶B及其磷酸化單克隆抗體1:2000(美國(guó)Eptomics公司)，小鼠抗小鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶及其磷酸化單克隆抗體1:500(美國(guó)BD公司)，兔抗小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9多克隆抗體1:15000(英國(guó)Abcam公司)，小鼠抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體1:5000(美國(guó)BioVision公司)］。用Quantity One圖象分析軟件(美國(guó)BIO-RAD公司)分析，將待測(cè)蛋白條帶與同一泳道β-肌動(dòng)蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果。

骨髓基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶活性測(cè)定:參照文獻(xiàn)［7］，明膠酶譜法測(cè)定骨髓上清基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶活性。利用Quantity One圖象分析軟件分析酶水解條帶反轉(zhuǎn)后的光密度值，作為酶活性強(qiáng)度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPASS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用x表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較再用Bonferroni檢驗(yàn)。兩個(gè)連續(xù)變量之間的相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

小鼠基本生理情況:試驗(yàn)前小鼠體重、血糖3組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體重:手術(shù)前糖尿病組較非糖尿病組減低(P＜0.01)，手術(shù)前胰島素組較非糖尿病組減低(P＜0.01);處死前糖尿病組較非糖尿病組減低，胰島素組較糖尿病組升高(P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血糖:手術(shù)前糖尿病組較非糖尿病組升高(P＜0.01)，手術(shù)前胰島素組較非糖尿病組升高(P＜0.01);處死前糖尿病組較非糖尿病組升高(P＜0.01)，胰島素組較糖尿病組下降(P＜ 0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(表1)

表1 3組小鼠基本生理情況比較(n=32， x)

表1 3組小鼠基本生理情況比較(n=32， x)

注:與非糖尿病組比較*P＜0.01;與糖尿病組比較ΔP＜0.01

體重(g)血糖(mmol/L)組別試驗(yàn)前 手術(shù)前 處死前非糖尿病組 25.0 ±1.1 31.5 ±2.5 29.6 ±2.0 6.7 ±0.9 6.7 ±1.6 6試驗(yàn)前 手術(shù)前 處死前.8 ±1.5糖尿病組 25.2 ±1.3 26.2 ±1.5* 23.3 ±2.3* 6.7 ±1.1 20.4 ±2.3* 20.5 ±2.8*胰島素組 25.1 ±1.2 25.9 ±1.7* 26.9 ±1.8Δ 6.8 ±0.6 19.9 ±2.5* 7.9 ±1.9Δ

缺血后不同時(shí)間外周血EPC數(shù)量變化情況(6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果):3組不同時(shí)間外周血EPC流式細(xì)胞儀檢測(cè)，術(shù)后3天外周血 EPC水平在非糖尿病組為2.98%，糖尿病組為0.97%，胰島素組為1.98%。由圖1可見(jiàn)，與術(shù)后0天比較，非糖尿病組術(shù)后1、3天外周血EPC數(shù)量增加(P＜0.01)，胰島素組術(shù)后3、7天外周血EPC數(shù)量增加(P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較:術(shù)后0、1、3、7天糖尿病組與非糖尿病組比較外周血EPC數(shù)量減少(P＜0.01)，術(shù)后3、7天胰島素組與糖尿病組比較外周血EPC數(shù)量增加(P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 術(shù)后不同時(shí)間各組外周血內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量變化情況 與術(shù)后0天比較?P＜0.01(n=6);與非糖尿病組比較*P＜0.01;與糖尿病組比較#P＜0.01。c-Kit:干細(xì)胞因子受體 Sca-1:干細(xì)胞抗原-1 Flk-1:胎肝激酶-1 PBMCs:外周血單個(gè)核細(xì)胞

胰島素治療改善糖尿病小鼠缺血誘導(dǎo)的血漿VEGF及SDF-1α釋放抑制:與外周血骨髓EPC動(dòng)員的變化趨勢(shì)一致，高峰期糖尿病組血漿VEGF及SDF-1α釋放水平較非糖尿病組明顯減低［VEGF:(85±12)pg/ml比(164 ±15)pg/ml，P ＜0.01;SDF-1α:(731±26)pg/ml比(1267 ±87)pg/ml，P ＜0.01］;胰島素組血漿VEGF及SDF-1α釋放水平較糖尿病組分別增加1.6及1.3倍［VEGF:(139±19)pg/ml比(85±12)pg/ml，P ＜0.01;SDF-1α:(972 ±40)pg/ml比(731 ±26)pg/ml，P ＜0.01］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

胰島素治療改善糖尿病小鼠骨髓動(dòng)員相關(guān)信號(hào)通路的活化障礙:術(shù)后3天時(shí)，糖尿病組缺血誘導(dǎo)的骨髓SDF-1α及VEGF釋放水平較非糖尿病組明顯減低［SDF-1α:(920±118)pg/ml比(1800±124)pg/ml，P ＜0.05;VEGF:(91 ±12)pg/ml比(223 ± 21)pg/ml，P ＜0.05］;蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，糖尿病組缺血術(shù)后骨髓細(xì)胞VEGF上調(diào)受抑制，且蛋白激酶B及內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化水平較非糖尿病組明顯減弱［VEGF:(0.18 ±0.06)比(0.45 ±0.07)，P ＜0.05;磷酸化蛋白激酶 B:(0.22 ±0.07)比(0.75 ±0.05)，P ＜0.05;磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶:(0.50 ±0.07)比(1.45 ±0.25)，P ＜0.05］;此外，糖尿病組缺血誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達(dá)及其酶活性較非糖尿病組明顯減低［基質(zhì)金屬蛋白酶-9 蛋白水平:(0.27 ±0.06)比(0.88 ±0.07)，P＜0.05;酶活性/μg蛋白:(260 ±24)比(480 ±52)，P＜0.05］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;單變量線性回歸分析表明，糖尿病組骨髓基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶活性受抑與其循環(huán)中 EPC水平減低相關(guān)(r=0.87，P＜0.01)。胰島素組缺血早期骨髓中SDF-1α及VEGF水平、骨髓細(xì)胞蛋白激酶B與內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化水平及基質(zhì)金屬蛋白酶-9酶活性較糖尿病組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

循環(huán)中的EPC可通過(guò)動(dòng)員歸巢、分化增殖、遷移整合等機(jī)制參與各種生理及病理狀態(tài)下的成體血管新生［1，2］，因此，缺血損傷后骨髓EPC 向外周血?jiǎng)訂T障礙可能是阻礙糖尿病個(gè)體代償性血管新生及側(cè)支形成的重要原因。

然而影響糖尿病骨髓EPC動(dòng)員的機(jī)制目前仍未清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)物缺血早期SDF-1α及VEGF的上調(diào)顯著受抑制，并伴隨其骨髓組織下游信號(hào)分子活化障礙。組織缺血缺氧發(fā)生后，損傷部位缺氧誘導(dǎo)因子1α誘導(dǎo)VEGF及SDF-1α的表達(dá)與釋放。在骨髓組織中，增多的VEGF與骨髓細(xì)胞表面受體結(jié)合后進(jìn)一步激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶/一氧化氮信號(hào)途徑，導(dǎo)致一氧化氮合成與釋放增加［3］。一氧化氮進(jìn)而誘導(dǎo)活性基質(zhì)金屬蛋白酶-9釋放，后者促進(jìn)EPC在骨髓內(nèi)募集并向外周血遷移［4］。SDF-1α亦可通過(guò)誘導(dǎo)蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶/基質(zhì)金屬蛋白酶-9信號(hào)通路活化機(jī)制促進(jìn)骨髓EPC動(dòng)員、并歸巢至損傷部位參與組織血管修復(fù)［4，9］。然而糖尿病時(shí)生成增加的氧化代謝毒物和高血糖本身可阻礙上述信號(hào)通路級(jí)聯(lián)激活，導(dǎo)致一氧化氮生物利用度降低以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9失活［8］。因此，糖尿病狀態(tài)下缺血誘導(dǎo)的SDF-1α與VEGF信號(hào)通路活化受損可能是造成骨髓EPC向外周血?jiǎng)訂T障礙的重要機(jī)制之一。

Humpert等［9］報(bào)道，胰島素治療增加2型糖尿病患者循環(huán)中CD34+/133+內(nèi)皮祖細(xì)胞水平，并且胰島素的這種動(dòng)員作用受到SDF-1調(diào)控。同樣地，我們發(fā)現(xiàn)，胰島素治療有效促進(jìn)糖尿病小鼠組織缺血后骨髓EPC動(dòng)員;同時(shí)胰島素明顯提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血誘導(dǎo)的血管活性因子SDF-1α及VEGF釋放水平、并促進(jìn)骨髓動(dòng)員相關(guān)信號(hào)通路級(jí)聯(lián)活化。這些功能改善一方面可能源于胰島素的直接誘導(dǎo)作用［10］，另一方面可能通過(guò)降低高血糖、減輕氧化應(yīng)激，從而恢復(fù)缺氧敏感系統(tǒng)活化。因此，我們認(rèn)為胰島素治療可能通過(guò)恢復(fù)缺血誘導(dǎo)的SDF-1α/VEGF相關(guān)信號(hào)通路活化機(jī)制，從而改善糖尿病小鼠骨髓EPC動(dòng)員障礙。

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