阿莫西林口服制劑微生物限度檢查方法學(xué)驗證研究

王艷，李曉平，劉珠，支麗娟，王淑娟（.河北省藥品檢驗所，石家莊市 0500；.河北省兒童醫(yī)院，石家莊市 0500；.長春工業(yè)大學(xué)，長春市 00）

阿莫西林為廣譜抗菌藥物，是目前應(yīng)用較為廣泛的口服青霉素之一。其制劑有膠囊、片劑、顆粒劑、分散片等。對該品種進(jìn)行微生物限度檢查時需要消除樣品的抑菌性，才能真實地反映其微生物污染情況。而普遍使用的平皿法不能消除阿莫西林的抑菌性；薄膜過濾法操作過程復(fù)雜，有人為污染的危險，同時無法確定每次試驗沖洗效果是否完全消除其抑菌性。因此十分有必要探索操作簡便、結(jié)果可信度高、可應(yīng)用敏感菌同步驗證的微生物限度檢查方法。

1 材料

1.1 試藥

阿莫西林分散片（張家口圣大藥業(yè)有限公司，批號:081106、081105、081107，規(guī)格:每片0.25 g）；阿莫西林顆粒（石藥集團中諾藥業(yè)有限公司，批號:080371，規(guī)格:每袋0.25 g；批號:081271，規(guī)格:每袋0.125 g；華北制藥集團，批號:090303，規(guī)格:每袋0.125 g）；阿莫西林膠囊（石家莊科迪藥業(yè)有限公司，批號:071005、070701、070901，規(guī)格:每粒0.5 g）。

pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、靛基質(zhì)試液（河北省藥品檢驗所制備）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號:0104002）、改良馬丁液體培養(yǎng)基（批號:001229）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號:011025）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號:100105）、玫瑰紅鈉培養(yǎng)基（批號:010608）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號:010607）、4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸（MUG，批號:010912）均由北京三藥科技開發(fā)有限公司提供；青霉素酶（張家口市格瑞生物化學(xué)科技有限公司，批號:20100402，規(guī)格:2400000 u·mL－1）。

1.2 對照菌

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]（中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

接種細(xì)菌計數(shù)方法對照菌，取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)20 h；接種酵母菌計數(shù)方法驗證用菌株，取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至5 mL改良馬丁液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)20 h；接種霉菌計數(shù)方法驗證菌株，取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d，加4 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。取上述1 mL各菌培養(yǎng)物或孢子液加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，制備各菌液（菌落數(shù)在10～100 cfu·mL－1）。

2.2 試驗方法

試驗組:取供試液1 mL，注入平皿中，加入“2.1”項下菌液1 mL，每株試驗菌平行制備2個平皿；菌液組:取5株試驗菌液各1 mL，分別注入平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿；供試品對照組:取供試液1 mL，分別注入平皿中，每種供試液平行制備2個平皿；稀釋劑對照組:取稀釋液1 mL，分別加入各菌懸液1 mL。上述各組，細(xì)菌計數(shù)檢查項注入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌及酵母菌計數(shù)檢查項注入玫瑰紅鈉培養(yǎng)基。按規(guī)定條件培養(yǎng)后，計算各試驗菌的回收率:試驗組的菌回收率＝（試驗組的平均菌落數(shù)－供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)×100%；稀釋劑對照組的菌回收率＝稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

2.3 供試液的制備及試驗結(jié)果

2.3.1 未加酶供試液。分別稱取9批供試品各10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃保溫振搖，使溶散；靜置取上清液作為1∶10供試液A，進(jìn)行平皿法驗證試驗，結(jié)果見表1。

由表1可見，該方法白色念珠菌和黑曲霉的回收率大于70%，因此采用該法可以進(jìn)行樣品的霉菌及酵母菌計數(shù)檢查；但金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的回收率均為0%，因此需要探索細(xì)菌計數(shù)方法并驗證。

表1 供試液A驗證試驗結(jié)果（回收率，%）Tab 1 Result of validation test of test sample A（recovery rate，%）

2.3.2 加酶供試液。分別稱取9批供試品各10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至98 mL，45℃保溫振搖，使溶散后至離心管中，500 r·min－1離心沉淀3 min；取上清液49 mL加青霉素酶1 mL搖勻，靜置30 min，作為1∶10供試液B，進(jìn)行平皿法驗證試驗，結(jié)果見表2。

表2 供試液B驗證試驗結(jié)果（回收率，%）Tab 2 Result of validation test of test sample B（recovery rate，%）

表2結(jié)果表明，阿莫西林顆粒和膠囊在該條件下，5株試驗菌的回收率均達(dá)到70%以上，該方法已經(jīng)消除了樣品的抑菌性，可以進(jìn)行樣品的細(xì)菌檢查。分散片遇水能迅速崩解形成均勻的黏性混懸液，低速離心不能使不溶性阿莫西林沉降，故其上清液中阿莫西林量較其他2種劑型中的量增加。該試驗條件不能使分散片中阿莫西林充分滅活，因此需要進(jìn)一步加大青霉素酶的用量，重新驗證大腸埃希菌的回收率。

2.3.3 加大酶量供試液。取3批分散片供試品各10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至96 mL，45℃保溫振搖，使溶散后至離心管中，500 r·min－1離心沉淀3 min，取上清液48 mL加青霉素酶2 mL搖勻，靜置30 min，作為1∶10供試液C，進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果3批樣品（081105、081106、081107）大腸埃希菌回收率分別為91.7%、89.6%、96.5%。

阿莫西林分散片的供試液B對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌沒有抑菌性，而對大腸埃希菌有抑菌性；加大青霉素酶量酶后制備的供試液C，阿莫西林滅活完全，消除了對大腸埃希菌的抑菌性。該結(jié)果表明阿莫西林微量存在時，大腸埃希菌較為敏感，因此，大腸埃希菌可以作為該藥品的敏感菌。

2.3.4 稀釋劑。取1 mL青霉素酶加49 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻，作為青霉素酶法的稀釋劑對照組D，進(jìn)行稀釋劑驗證試驗，結(jié)果見表3。

由表3可見，該稀釋劑各試驗菌回收率均大于70%，說明稀釋劑對試驗結(jié)果沒有影響。

2.3.5 控制菌大腸埃希菌檢查方法驗證。取100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基4份，第1份加入10 mL供試液B，第2份加入10 mL供試液B和大腸埃希菌的菌懸液1 mL，第3份加入大腸埃希菌的菌液1 mL、第4份加稀釋劑10 mL。35℃培養(yǎng)18～24 h后，各取0.2 mL，分別加至5 mL MUG中，35℃培養(yǎng)5、24 h，將各管置于365 nm紫外燈下觀察有無藍(lán)白色熒光，然后加靛基質(zhì)試液4～5滴于上述MUG管內(nèi)，觀察液面顏色。有熒光（MUG）及呈玫瑰紅色（indole）說明檢出大腸埃希菌，記為“+”；無熒光及無色說明未檢出大腸埃希菌，記為“-”，結(jié)果見表4。

表3 稀釋劑D驗證試驗結(jié)果（回收率，%）Tab 3 Result of validation test of thinners D（recovery rate，%）

表4 大腸埃希菌檢查方法驗證結(jié)果Tab 4 Validation result of the method of Escherichia coli

由表4可見，供試液B第2份試驗組結(jié)果表明檢出大腸埃希菌，說明該方法可以作為控制菌大腸埃希菌的檢查方法。

2.3.6 樣品檢查。取9批供試品，霉菌及酵母菌計數(shù)采用平皿法檢查。其細(xì)菌計數(shù)檢查分為2種:膠囊和顆粒按供試液B制備方法采用平皿法檢查，分散片按供試液C制備方法采用平皿法檢查，結(jié)果見表5。

表5 樣品檢查結(jié)果（菌落計數(shù)，cfu·g－1）Tab 5 Results of sample test（counts，cfu·g－1）

3 討論

依據(jù)阿莫西林在水中微溶[1]的特性，取10 g供試品加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，溶散后低速離心制備的上清液，大部分主藥均在沉淀物中。假設(shè)上清液中不含不溶性阿莫西林，理論上其中阿莫西林可能的最大含量為1 g·100 mL－1。因此，上清液中的阿莫西林含量幾乎不受樣品規(guī)格中主藥含量的影響，而輔料則是影響上清液中阿莫西林含量的主要因素。

由于上清液中含阿莫西林可能的量為1 g·100 mL－1（1 mg阿莫西林相當(dāng)于1400 u青霉素），即100 mL的上清液中含1400000 u的青霉素。理論上加2～4倍單位的青霉素酶可使青霉素滅活[2]。供試液C中，50 mL的上清液約含相當(dāng)于700000 u的青霉素，因此，用2400000 u的青霉素酶1 mL可以使其滅活。

供試液加入青霉素酶后，應(yīng)使二者充分混勻，并靜置約30 min使β-內(nèi)酰胺完全滅活，觀察現(xiàn)象可見溶液由渾濁變?yōu)槌吻濉?/p>

阿莫西林分散片在生產(chǎn)過程中，將原料藥進(jìn)行微粉化處理，選用了良好的崩解劑，在水中形成均一的混懸液，因此供試液離心沉淀后上清液中阿莫西林量增加，故青霉素酶的用量需要加倍，才可消除對試驗菌的抑菌性。依據(jù)該試驗結(jié)果，應(yīng)考慮輔料對不同劑型供試品的上清液中阿莫西林含量的影響，對青霉素酶用量進(jìn)行驗證。

阿莫西林口服制劑有膠囊、片劑、顆粒劑、分散片。分散片是在片劑的基礎(chǔ)上，添加了以增強其黏性為目的的工序。而片劑供試液的黏性低于分散片，上清液中阿莫西林量不高于分散片。因此本試驗中分散片的研究結(jié)果可代替普通片劑，故不再選取普通片劑進(jìn)行試驗。本研究結(jié)果對阿莫西林口服制劑的微生物限度檢查有普遍意義。

對完全滅活的供試液采用平皿法進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)檢查，即可有效檢出供試品中污染的微生物。該方法較薄膜過濾法簡便易行，操作環(huán)節(jié)少，并可減少操作過程中的污染機會。

大腸埃希菌為該樣品的敏感菌，每批樣品檢查時應(yīng)進(jìn)行大腸埃希菌的回收率試驗?；厥章蚀笥?0%，證明細(xì)菌檢查結(jié)果無誤，檢驗結(jié)果準(zhǔn)確；如果回收率小于70%，表明沒有完全消除供試品的抑菌性，需重新檢查。該方法可保證每批次供試品的試驗結(jié)果可信。

阿莫西林對白色念珠菌和黑曲霉無抑菌作用，因此對于霉菌及酵母菌檢查可以采用平皿法檢查。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:401.

[2]蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢查技術(shù)[M].北京:華齡出版社，2007:265.