LC-ESI-MS/MS法測定草棉花瓣提取物中組氨酸的含量

賽力曼·哈得爾，艾則孜·莫合買提（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊市 830054；2.新疆食品藥品檢驗(yàn)所，烏魯木齊市 830000）

草棉[1]，又名小棉、非洲棉，屬錦葵科，是新疆主要栽培棉種，資源十分豐富。草棉花瓣提取物含有組氨酸，是一種非必需氨基酸，由于其側(cè)鏈中含有氨基，具有堿性，故屬于堿性氨基酸。同其他氨基酸一樣，它是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成部分，參與動物機(jī)體中蛋白質(zhì)的合成，同時還以多種形式廣泛參與機(jī)體的各種生理生化過程，并具有抗老年癡呆和抗血栓的作用，目前在臨床上用于治療心臟病、貧血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。但是，組氨酸在人體內(nèi)易轉(zhuǎn)化為組胺，造成人體內(nèi)組胺蓄積，誘發(fā)頭暈、頭痛、心慌等不適癥狀，故需對其含量進(jìn)行測定與控制。

組氨酸結(jié)構(gòu)中存在羥基、羧基、氨基等基團(tuán)，需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生化才能用高效液相色譜（HPLC）法[2]測定。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）法得到了快速發(fā)展，它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)HPLC的缺點(diǎn)，三重四極桿質(zhì)譜作為其中的代表被廣泛用于低濃度藥物含量的研究領(lǐng)域。液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）法[3]檢測無需進(jìn)行衍生化便可直接測定，故筆者建立了以LC-ESI-MS/MS法測定草棉花瓣提取物中組氨酸含量的方法。本方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于草棉花瓣提取物的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series HPLC儀，包括G1322A真空在線脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1316A程溫箱、G1315 DAD檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；QTRAP LCMS/MS三重四極桿MS/MS儀，配備電噴霧離子源（ESI）、Analyst 1.4.2工作站（美國Applied Biosystems公司）；AG-135型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Gilson精密移液器（北京吉爾森科技有限公司）。

組氨酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:624-200104）；草棉花瓣提取物由中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所提供并鑒定；甲醇、甲酸均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取組氨酸對照品0.01027 g，置于10mL量瓶中，加流動相使溶解并稀釋至刻度，再取1.0mL置于10mL量瓶中，加流動相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得組氨酸濃度為102.7μg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取草棉花瓣提取物粉末（過三號篩）約0.20 g，置10.0mL量瓶中，加流動相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.2 分析條件

2.2.1 LC條件 色譜柱:Altima HP HILIC（150mm×2.1mm×3.0 μm）；流動相:甲醇-0.1%甲酸溶液（10∶90）；流速:0.20mL·min-1；柱溫:室溫。

2.2.2 MS條件 離子源:ESI；正離子掃描方式；離子噴射電壓（IS）:5500 V；離子源溫度（TEM）:380℃；霧化氣1（GS1）壓力:65 psi；干燥氣2（GS2）壓力:60 psi；氣簾氣（CUR）壓力:25 psi；檢測方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）；碰撞能量（CE）:19 V；去簇電壓（DP）:55 V；用于定量分析的離子反應(yīng)為:m/z 156.4→m/z 110.1。MS與HPLC圖分別見圖1、圖2。

圖1 質(zhì)譜圖A.組氨酸的MS圖；B.組氨酸[M+H]（+m/z 156）的二級MS圖Fig 1 Mass chromatogramsA.MS chrometograms of histidine；B.MS2of[M+H]+（m/z 156）of histidine

圖2 組氨酸MRM檢測獲得的色譜圖A.組氨酸對照品；B.樣品（批號:20050303）Fig 2 Chromatograms of histidine detected with MRMA.histidine control；B.sample（lot num:20050303）

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取上述組氨酸對照品溶液適量，用流動相分別稀釋成濃度為0.05135、0.10270、0.20540、0.30810、0.41080、0.51350、0.61620μg·mL-1的系列對照品溶液。取10μL進(jìn)樣，測定峰面積。以在MRM下選擇離子的峰面積積分值（Y）對其濃度（X，μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝576613X－4482（r＝0.9995，n＝7）。結(jié)果表明，組氨酸檢測濃度在0.05135～0.61620μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 檢測限和定量限測定

取對照品溶液適量，用流動相依次稀釋制成一系列由高到低梯度濃度的溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣，取MS峰面積為信噪聲3倍（S/N＝3）計算檢測限為1.65 ng·mL-1，10倍（S/N＝10）計算定量限為10.27 ng·mL-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述組氨酸對照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.9%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號:20050303）適量，共6份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計算含量。結(jié)果，樣品中組氨酸的平均含量為0.050%，RSD＝1.6%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批（批號:20050303）供試品溶液適量，分別于0、3、6、12、18、24h測定組氨酸的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.3%（n＝6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品約0.20 g，共9份，精密稱定，每3份為一組，分別精密加入對照品溶液1.0、3.0、5.0μL，用流動相定容至10mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為99.8%，RSD＝1.5%（n＝9）。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，3批樣品（批號:20070604、20050303、20050428）中組氨酸的含量分別為0.051%、0.053%、0.042%，RSD分別為1.7%、0.9%、1.6%。

3 討論

本試驗(yàn)采用LC-ESI-MS/MS法測定草棉花瓣提取物中組氨酸含量，樣品無需衍生化可直接進(jìn)樣分析，不需要煩瑣的前處理，減少了測定誤差，結(jié)果可靠。

氨基酸的ESI-MS分析既可采用正離子模式也可使用負(fù)離子檢測。組氨酸采用正離子模式分析，以[M+H]+（m/z 156）作為母離子進(jìn)行二級MS裂解，主要產(chǎn)生m/z142.4、110.1等特征離子，MRM選擇母離子m/z156.4和子離子110.1測定。

在對流動相的選擇上，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等流動相。結(jié)果表明，加入甲酸對組氨酸靈敏度影響較大，最終選擇了甲醇-0.1%甲酸溶液。

[1]新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳編.維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)（上冊）[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:357.

[2]鄢 丹，李 果，等.反相高效液相色譜法直接測定水蛭中14種未衍生氨基酸的含量[J].分析化學(xué)，2006，34（5）:705.

[3]劉 影，賀玖明，陳艷華，等.無需母離子選擇可獲得二級質(zhì)譜的RRLC-MS/MS方法研究[J].質(zhì)譜學(xué)報，2007，28（增刊）:6.