正交試驗(yàn)優(yōu)化補(bǔ)腎健骨片中青風(fēng)藤的提取工藝

張愛麗，易文斌（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，連云港市 222006；2.南京理工大學(xué)，南京市 210094）

補(bǔ)腎健骨顆粒為江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院附屬醫(yī)院制劑，由淫羊藿、青風(fēng)藤、茯苓等多味中藥組成，具有補(bǔ)腎壯骨、益氣活血功效。主要適用于中老年患者，需長(zhǎng)期服用。原劑型存在服用藥量大、顆粒易吸潮結(jié)塊等缺點(diǎn)，故筆者擬將顆粒劑改為片劑，以便于臨床應(yīng)用。在分析藥材性質(zhì)的基礎(chǔ)上，對(duì)處方中淫羊藿、黃芪、茯苓等藥材采用水提取法[1]；對(duì)處方中青風(fēng)藤采用乙醇提取。為了盡可能地提取有效成分青藤堿，本次試驗(yàn)對(duì)乙醇提取的不同方法進(jìn)行優(yōu)選；并以青藤堿含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法考察了乙醇濃度、乙醇用量、pH值、藥材粒度4個(gè)因素對(duì)有效成分的影響，以期得到良好的乙醇連續(xù)滲漉提取效果，為該制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供合理依據(jù)。

1 儀器與試藥

SLG-500型連續(xù)滲漉提取罐（常州宇通干燥設(shè)備有限公司）；1100型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；微孔濾膜、真空泵抽濾裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；AB204-S分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

青風(fēng)藤藥材購(gòu)自江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院中藥飲片廠，經(jīng)連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校楊成俊副教授鑒定為真品；青藤堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):0774-200206）；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 青藤堿含量測(cè)定[2]

2.1.1 色譜條件色譜柱:ODS-C18（鉆石）（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇-0.005 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液（以1%乙二胺調(diào)節(jié)pH 9.0＝55∶45；流速:1.0mL·min-1；柱溫:30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):262 nm；進(jìn)樣量:10μL。理論板數(shù)按青藤堿峰計(jì)算不低于1500。色譜見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取青藤堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含1.25mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方量的青風(fēng)藤藥材，分別按正交試驗(yàn)安排制備，所得樣品溶液減壓濃縮，定容至100mL量瓶中，精密吸取0.1mL至100mL量瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇稀釋，定容，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取青藤堿對(duì)照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定青藤堿峰面積。以峰面積積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y＝2404.67X+17.84（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，青藤堿進(jìn)樣量在2.5～22.5μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 含量測(cè)定 分別取供試品和對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入HPLC儀，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算青藤堿含量。

2.2 乙醇不同提取方法優(yōu)選

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，青藤堿為青風(fēng)藤藥材的主要有效成分。但對(duì)其有效成分提取工藝的研究報(bào)道不多。筆者在參考有關(guān)文獻(xiàn)[3]的基礎(chǔ)上，以乙醇為溶劑采用浸漬法、連續(xù)滲漉法、回流法對(duì)藥材進(jìn)行提取工藝優(yōu)選。每種提取方法中乙醇濃度分別設(shè)為95%、85%、75%、75%（pH 8～9）和65%（pH 8～9），共5個(gè)水平，乙醇用量約為藥材量的12倍。不同提取方法比較結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法比較結(jié)果Tab 1 Results of different extraction methods

由表1可知，以青藤堿含量為指標(biāo)，在提取方法相同的條件下，乙醇濃度越大青藤堿含量越高；在溶劑相同的條件下，連續(xù)滲漉法較浸漬法好，而與回流法接近；加堿的乙醇可較大提高青藤堿的含量。考慮到減少雜質(zhì)、降低能耗、操作簡(jiǎn)便等因素，同時(shí)盡可能獲得較高的含量等，本工藝采用乙醇連續(xù)滲漉法提取。

2.3 乙醇連續(xù)滲漉提取工藝參數(shù)優(yōu)化

在確定選用乙醇連續(xù)滲漉提取青風(fēng)藤的工藝后，還要考慮滲漉條件對(duì)青藤堿含量的影響。影響因素有乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、藥材粒度（C）、pH值（D）及滲漉速度等[4]?！吨袊?guó)藥典》將滲漉速度分為慢滲和快滲兩種，慢滲為1～3mL·kg-l·min-l，快滲為3～5mL·kg-l·min-l。本次屬小型試驗(yàn)，若滲漉速度過(guò)快，則有效成分可能來(lái)不及浸出和擴(kuò)散，從而導(dǎo)致青藤堿含量低，故統(tǒng)一控制滲漉速度為1～3mL·kg-l·min-l。前4個(gè)影響因素中每個(gè)因素選3個(gè)水平，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表2。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

精密吸取供試品溶液10μL，按上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算青藤堿含量。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

由表3、表4可知，因素A、B、D對(duì)試驗(yàn)有顯著性影響（P＜0.01），因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，各因素對(duì)青藤堿含量影響大小的順序?yàn)镈＞A＞B＞C。由于因素C影響較小，可任意取一水平，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和節(jié)省能源角度考慮，擬選取C1，以因素C作為誤差估計(jì)，最佳提取工藝為A3B3C1D2，即藥材粉碎過(guò)10目篩，以12倍量75%乙醇（用氨水調(diào)節(jié)pH 8～9）連續(xù)滲漉提取。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3批處方量青風(fēng)藤藥材，按上述最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，青藤堿的平均含量為（7.04±0.03）mg·g-l，與正交試驗(yàn)得到的青藤堿最高含量相當(dāng)，故該工藝可作為青風(fēng)藤的提取工藝。

3 討論

從青藤堿結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以判斷其呈弱堿性，為提高青藤堿的含量，故在提取工藝比較中選用堿化乙醇。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]采用石灰堿化法調(diào)pH值，考慮到隨著石灰用量的增加將導(dǎo)致產(chǎn)品含鈣量超標(biāo)的可能性，本試驗(yàn)采用氨水調(diào)pH值，用量控制在0.7%即可保證pH值在8～9的范圍。

本試驗(yàn)分別采用不同濃度的乙醇提取青藤堿。結(jié)果表明，高濃度乙醇的提取物含較多樹脂等極性小的化合物，難以干燥，而低濃度乙醇的提取物含樹脂等極性小的化合物較少，容易干燥，但乙醇的濃度太低，提取率低，溶劑回收困難。結(jié)果顯示，65%～75%中等濃度乙醇有較高的提取率，也容易回收溶劑。

青藤堿的檢測(cè)方法是在參考文獻(xiàn)[6]和《中國(guó)藥典》試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上以不同條件摸索改進(jìn)而成，得到的峰形好、保留時(shí)間短，分離效果好。

[1]張愛麗，潘衛(wèi)東.補(bǔ)腎健骨片水煎藥材的提取、純化及制劑工藝研究[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，16（4）:42.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:181.

[3]宋永彬，程維明，曲戈霞，等.青風(fēng)藤化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24（2）:79.

[4]王桂蓉，黃 濤.延生口服液提取工藝的研究[J].中國(guó)藥房，2001，12（8）:456.

[5]王曉玲，溫普紅，馮列梅.青藤堿提取工藝的優(yōu)化[J].中草藥，2001，32（8）:702.

[6]張義生，袁小艷，張荒生，等.高效液相色譜法測(cè)定痹痛定膠囊中青風(fēng)藤的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（9）:208.