丹參抑制人粘連成纖維細(xì)胞增殖的作用研究Δ

曾煦欣，王芳，蔣泓，鄺嘉樂（.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，佛山市 528000；2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院中藥藥劑系，廣州市 50006）

腹部手術(shù)后粘連（術(shù)后粘連）是腹膜受到手術(shù)損傷與刺激后，臟器之間、臟器與腹壁之間產(chǎn)生的纖維性粘連，發(fā)生率達(dá)90%以上，常導(dǎo)致腹部慢性疼痛和女性不孕，嚴(yán)重者可發(fā)展為腸梗阻甚至死亡[1]。研究顯示，丹參可通過抑制膠原生成、促進(jìn)膠原降解預(yù)防術(shù)后粘連生成，但具體機(jī)制尚未明確，影響其進(jìn)一步推廣應(yīng)用[2]。在粘連形成過程中，成纖維細(xì)胞的增殖與膠原合成是主要因素[3]，因此該細(xì)胞很可能是丹參防治術(shù)后粘連的作用靶點(diǎn)。為證實(shí)這一推測(cè)，本研究利用MTT法與Real-time PCR法考察丹參及其主要成分對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，對(duì)該藥防治術(shù)后粘連的具體機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行探討。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿與培養(yǎng)瓶（美國Cornig公司）；E045型CO2培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；超凈臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DM-IRB型倒置顯微鏡（德國Leica公司）；3K18型臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；680型酶標(biāo)儀、MiniOpticon型Real time PCR儀（美國Bio-Rad公司）；TGRADIENT型PCR儀（德國Biometra公司）。

1.2 試藥

丹參凍干粉（南方醫(yī)院藥學(xué)部提供，丹參素含量8%～15%，批號(hào):20070630）；丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào):110781-20091）、丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)照品（批號(hào):111605-200301）由中國藥品生物制品檢定所提供；地塞米松注射劑（成都天臺(tái)山制藥有限公司，批號(hào):080202）；DMEM高糖培養(yǎng)基（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；0.25%胰酶（美國Gibco公司）；MTT（美國Sigma公司）；二甲基亞砜（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；RNAprep試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；RT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM（大連寶生物工程有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 粘連成纖維細(xì)胞（AFB）的體外培養(yǎng)

取人體粘連組織，按照文獻(xiàn)方法[4]進(jìn)行AFB的原代培養(yǎng)，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)條件:含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，溫度37℃，CO2濃度5%，相對(duì)濕度95%。

2.2 丹參對(duì)AFB增殖活性的影響

按照文獻(xiàn)方法[2]，將AFB接種于96孔板，經(jīng)貼壁、同步化處理后，各孔分為丹參凍干粉（Dashen Powder，DSP）、丹參素（Danshensu，DSS）、丹參酮ⅡA（Danshinone ⅡA，DⅡA）和地塞米松（Dexamethasone，DEX）組，每組均設(shè)8個(gè)濃度，分別為0、2.5、5、10、20、40、80、160μg·mL-1，每一濃度均設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后按MTT法測(cè)定各孔吸光度。使用公式（1）計(jì)算各孔的AFB活性（Viability），公式（2）計(jì)算藥物對(duì)AFB的抑制率（Inhibition rate，IR），采用SPSS 12.0中的Probit回歸進(jìn)行劑量-抑制率關(guān)系分析，求出丹參和地塞米松對(duì)AFB的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

結(jié)果表明，隨著劑量增加，AFB活性下降幅度最大的是DSP組，DSS組次之，隨后依次為DEX組與DⅡA組；IC50由低到高依次為DSS組、DSP組、DEX組、DⅡA組。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0進(jìn)行One-way ANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各組IC50均存在顯著性差異（P＜0.01）。藥物對(duì)AFB增殖的IC50測(cè)定結(jié)果見表1；藥物作用48 h后AFB的活性見圖1。

表1 藥物對(duì)AFB增殖的IC50測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of IC50of drug against the proliferation of AFB（n＝3）

圖1 藥物作用48 h后AFB的活性（%，n＝4）Fig 1 Activity of AFB after treated with drug for 48 h（%，n＝4）

2.3 丹參對(duì)AFB TGF-β1mRNA表達(dá)水平的影響

將AFB接種于?6cm培養(yǎng)皿，每皿細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)，經(jīng)貼壁、同步化處理后，分為DSP、DSS、DⅡA和DEX組，每組均設(shè)3個(gè)藥物處理濃度，分別為2.5、10、40μg·mL-1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（Control），每組均設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。各組均使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，終體積均為5mL。培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后置－20℃下凍存，待用。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的人體mRNA序列，用Prime Premier軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參β-actin與目的基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1的引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司（Invitrogen）合成。按照SYBR?Premix Ex TaqTM中的25μL體系進(jìn)行Real time PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火/延伸30s，40個(gè)循環(huán)。記錄周期閾值（CT值），采用文獻(xiàn)的2-ΔΔCT法，按公式（3）計(jì)算各個(gè)藥物組相對(duì)于空白對(duì)照組的TGF-β1mRNA表達(dá)倍數(shù)F:

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0進(jìn)行One-way ANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果顯示DSP、DSS各劑量組以及DEX高劑量組（40μg·mL-1）的TGF-β1mRNA水平均與空白對(duì)照組（F＝1.00）存在顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）；而且DSP與DSS組的TGF-β1mRNA水平隨著劑量增加而下降，各劑量組之間存在顯著性差異（P＜0.01），呈現(xiàn)一定劑量依賴關(guān)系。Real-time PCR檢測(cè)用引物序列見表2；TGF-β1mRNA表達(dá)結(jié)果見表3。

表2 Real-time PCR檢測(cè)用引物序列Tab 2 Primer sequence of Real-time PCR

表3 TGF-β1mRNA表達(dá)結(jié)果（n＝3）Tab 3 Result of TGF-β1mRNAexpression（n＝3）

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)術(shù)后粘連主張使用活血化瘀、補(bǔ)氣理氣的治則。丹參具有活血行血和化瘀滯的功效，因而被大量經(jīng)方、驗(yàn)方與中藥制劑采用；同時(shí)大量研究也證實(shí)丹參具有抗纖維化、改善血液微循環(huán)與抗炎的藥理作用，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)粘連防治策略相符[2，5]。故無論從中醫(yī)角度還是從西醫(yī)角度出發(fā)，丹參均是粘連防治的理想藥物，前景廣闊。近年的研究表明，成纖維細(xì)胞在腹膜損傷部位的遷移和增殖是術(shù)后粘連形成的關(guān)鍵。更有文獻(xiàn)提出今后粘連研究方向應(yīng)該集中到探討成纖維細(xì)胞、間皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在粘連部位的特性與行為，以及它們與胞外微環(huán)境的相互聯(lián)系上[3]。文獻(xiàn)顯示，抑制膠原生成、促進(jìn)膠原降解、抑制促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)是丹參預(yù)防術(shù)后粘連生成的機(jī)制[3]，而損傷腹膜處成纖維細(xì)胞分泌合成膠原是引起沉積的纖維蛋白機(jī)化的主要原因[2，6]。筆者據(jù)此推斷AFB可能是丹參防治粘連的主要作用靶點(diǎn)，故從人體粘連組織中培養(yǎng)出AFB，用于丹參粘連防治機(jī)制的研究。

研究結(jié)果表明，DSP、DSS作用下AFB活性的下降幅度要高于DⅡA與DEX，而且IC50也顯著低于DⅡA與DEX（P＜0.01），說明丹參可抑制AFB的增殖，而且水溶性成分DSS的作用強(qiáng)于脂溶性成分DⅡA和陽性對(duì)照藥DEX；同時(shí)，DSP與DSS均能使AFB的TGF-β1mRNA水平下調(diào)，并呈一定劑量依賴關(guān)系，DⅡA、DEX對(duì)TGF-β1mRNA水平影響則不大，進(jìn)一步說明丹參通過下調(diào)AFB的TGF-β1mRNA水平來抑制AFB增殖，而且主要起效成分為水溶性的DSS。上述結(jié)果初步證實(shí)了筆者的設(shè)想，揭示了丹參抑制AFB過度增殖防治粘連的機(jī)制，為下一步從分子水平探討丹參的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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