西格列汀對(duì)db/db糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

程茅薇，顧 萍，馬 健，杜 宏，盧 斌，邵加慶

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其主要臨床表現(xiàn)為肢體麻木、疼痛和肌肉萎縮。如得不到及時(shí)控制，將導(dǎo)致糖尿病患者致殘率和死亡率明顯升高［1－2］。糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療主要是在嚴(yán)格控制血糖的基礎(chǔ)上進(jìn)行對(duì)癥治療，雖然一些新的治療糖尿病神經(jīng)病變的藥物針對(duì)病因治療如α－硫辛酸、醛糖還原酶抑制劑等，但目前仍缺乏特異性的有效治療。

近年來(lái)有研究證實(shí)胰高血糖素樣肽1(GLP－1)對(duì)周圍神經(jīng)具有神經(jīng)樣生長(zhǎng)因子 (NGF)作用，其機(jī)制與保護(hù)β細(xì)胞類似［3］。二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidaseⅣ，DPP－Ⅳ)抑制劑，作為新的治療2型糖尿病的藥物，通過(guò)選擇性抑制DPP－Ⅳ，減少GLP－1的降解，從而延長(zhǎng)GLP－1的作用時(shí)間，促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖，保護(hù)β細(xì)胞功能。但DPP－Ⅳ抑制劑對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。本研究通過(guò)觀察DPP－Ⅳ抑制劑西格列汀對(duì)db/db糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響，來(lái)探討DPP－Ⅳ抑制劑對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選取60只12周齡清潔級(jí)雄性C57BL/KsJ－db/db糖尿病小鼠，體質(zhì)量為35～45 g。按隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為3組:db/db組、西格列汀組、二甲雙胍組，每組20只。另選取20只同周齡同窩出生的db/m非糖尿病小鼠為對(duì)照組。db/db組、西格列汀組、二甲雙胍組小鼠的體質(zhì)量間有可比性，但均顯著高于對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量 (見(jiàn)表1)。

1.2 方法 db/db組、西格列汀組、二甲雙胍組分別給予8周的安慰劑 (5%阿拉伯膠)、西格列汀 (澳大利亞默沙東藥業(yè)有限公司)10 mg·kg－1·d－1、二甲雙胍 (中美上海施貴寶制藥有限公司)150 mg·kg－1·d－1。動(dòng)物的處置均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物看護(hù)原則。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 生理生化指標(biāo)檢測(cè) 每周監(jiān)測(cè)小鼠的體質(zhì)量和血糖，投藥前和投藥8周后測(cè)定空腹血糖 (FBG)、空腹胰島素(FINS)，F(xiàn)INS測(cè)定使用小鼠胰島素ELISA試劑盒 (Morinaga，Yokohama，Japan)。

1.3.2 腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn) (IPGTT) 投藥8周后，每組隨機(jī)選取10只小鼠行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn) (IPGTT)，用胰島素曲線下面積評(píng)價(jià)胰島分泌功能。

1.3.3 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定 采用丹麥KEYPOINT.NET肌電圖儀測(cè)定。將清醒db/m及db/db糖尿病小鼠俯臥位固定，刺激針電極置于股骨大粗隆與坐骨結(jié)節(jié)之間坐骨神經(jīng)傳出部位，記錄針電極置于踝關(guān)節(jié)處坐骨神經(jīng)經(jīng)過(guò)部位，參考電極置于刺激電極與記錄電極之間，與記錄電極相距1 cm，3種電極均采用針電極。刺激用單脈沖方波，波寬0.1 ms，強(qiáng)度1.5倍閾值。每?jī)蓚€(gè)刺激問(wèn)隔6 s以上。嚴(yán)格控制竄溫 (20.0±0.5)℃，并保持動(dòng)物體溫37℃。記錄刺激開(kāi)始到肌肉出現(xiàn)誘發(fā)電位的時(shí)間 (即潛伏時(shí)間)，測(cè)定刺激電極到記錄電極之間的距離，計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度 (MNCV)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前后的資料比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生理生化指標(biāo)比較 基線時(shí)，西格列汀組、二甲雙胍組、db/db組小鼠的體質(zhì)量及FBG、FINS水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，但均顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05)。治療8周后，西格列汀組和二甲雙胍組小鼠體質(zhì)量及FBG、FINS水平均顯著低于db/db組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05);而二甲雙胍組FINS水平顯著低于西格列汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)，余指標(biāo)兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05見(jiàn)表1)。

表1 4組小鼠基線及終點(diǎn)時(shí)體質(zhì)量及FBG、FINS水平比較(x—±s)Table 1 The comparison of weight，F(xiàn)BG，and FINSand metabolic parameters before and after treatment

2.2 小鼠IPGTT結(jié)果比較 糖負(fù)荷后120 min，西格列汀組、二甲雙胍組、db/db組小鼠葡萄糖曲線下面積、胰島素曲線下面積均顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05)，而西格列汀組、二甲雙胍組顯著低于db/db組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05);但西格列汀組、二甲雙胍組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表2、圖1、圖2)。提示西列他汀和二甲雙胍均能改善糖耐量及胰島素敏感性。

2.3 小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較 治療8周后db/db組、西格列汀組、二甲雙胍組小鼠MNCV顯著低于對(duì)照組 (p＜0.05)，而西格列汀組MNCV顯著高于db/db組及二甲雙胍組(p＜0.05)，而二甲雙胍與db/db組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示西格列汀能提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，其作用獨(dú)立于降糖作用 (見(jiàn)表3)。

表2 4組小鼠治療后血糖及胰島素曲線下面積比較Table 2 The comparison of glucose and insulin concentrations in IPGTT

圖1 葡萄糖曲線下面積Figure 1 Glucose concentrations in IPGTT

圖2 胰島素曲線下面積Figure 2 Glucose concentrations in IPGTT

表3 治療前后4組小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較(x—±s，m/s)Table 3 The comparison of motor nerve conduction velocity of sciatic nerve

3 討論

西格列汀作為DPP－Ⅳ抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DPP－Ⅳ的活性部位，選擇性抑制DPP－Ⅳ酶，減少GLP－1的降解，延長(zhǎng)GLP－1的作用時(shí)間，刺激胰島β細(xì)胞再生，促進(jìn)餐后胰島素分泌，抑制內(nèi)源性葡萄糖的生成［4］。本研究通過(guò)觀察西格列汀對(duì)db/db糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響，發(fā)現(xiàn)西格列汀不僅可以降低db/db小鼠血糖，同時(shí)能提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變具有保護(hù)作用，且獨(dú)立于降糖效應(yīng)之外。

在糖尿病中，高血糖主要通過(guò)多元醇、己糖胺、蛋白激酶C及終末糖基化產(chǎn)物等途徑［5－6］，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化還原狀態(tài)失衡及產(chǎn)生過(guò)多的活性氧物質(zhì)，最終引起周圍神經(jīng)病變。雖然目前一些治療藥物針對(duì)病因治療，但對(duì)高血糖引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)作用仍不理想。胰高血糖素樣肽作為體內(nèi)一種主要的生理性腸促胰島素，能降低血糖，促進(jìn)胰島素的合成和分泌，保護(hù)β細(xì)胞功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)GLP－1受體 (GLP－1R)不僅存在于胰島細(xì)胞中，在腎臟、心臟、胃、肺和周圍及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等都有表達(dá)［7］。研究證實(shí)GLP－1不僅能降糖，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)亦有保護(hù)作用，其機(jī)制與抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善血供等相關(guān)［8－10］。然而，GLP－1作為一種腸促胰島素，易被DPP－Ⅳ迅速降解，作用時(shí)間短暫，而DPP－Ⅳ抑制劑通過(guò)抑制DPP－Ⅳ酶，減少GLP－1的降解，從而延長(zhǎng)GLP－1的作用時(shí)間。Jin等［11］觀察到DPP－Ⅳ抑制劑維格列汀治療能明顯減少STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度下降，但對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)db/db糖尿病小鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度較正常小鼠顯著降低，證實(shí)糖尿病小鼠存在周圍神經(jīng)損害。西格列汀干預(yù)db/db小鼠8周后，不僅能降低血糖、改善葡萄糖耐量及胰島素敏感性，還能提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。與二甲雙胍組比較，雖然兩組治療后血糖無(wú)顯著差異，但西格列汀組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著快于二甲雙胍組，提示西格列汀改善周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度的作用是獨(dú)立于降糖作用。其機(jī)制可能與GLP－1/GLP－1R途徑有關(guān)，通過(guò)作用于GLP－1R，直接或間接激活神經(jīng)保護(hù)的信號(hào)通路。同時(shí)西格列汀對(duì)周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度的改善作用也證實(shí)GLP－1對(duì)周圍神經(jīng)的保護(hù)作用，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，西格列汀在降低血糖的同時(shí)，還能提高坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善糖尿病周圍神經(jīng)病變，為糖尿病神經(jīng)病變的治療尋找新的有效的治療手段提供了理論基礎(chǔ)。

1 劉曉云.舒血寧注射液聯(lián)合甲鈷胺治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床觀察［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2010，10(6):1343.

2 高潤(rùn)祥，牛國(guó)地，馬祥銘.血栓通注射液治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效觀察 ［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2009，9(28):6855.

3 Perry T，Holloway HW，Weerasuriya A，et al.Evidence of GLP－1－mediated neuroprotection in an animal model of pyridoxine－induced peripheral sensory neuropathy ［J］.Exp Neurol，2007，203:293 －230.

4 Ahren B.DPP－4 inhibitors［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2007，21:517－533.

5 劉業(yè)強(qiáng)，朱育剛，史麗萍，等.糖尿病周圍神經(jīng)病變患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的研究［J］.疑難病雜志，2009，8(4):228.

6 Nakagawa A，Satake H，Nakabayashi H，et al.Receptor gene expression of glucagon－like peptide－1，but not glucose－dependent insulinotropic polypeptide，in rat nodose ganglion cells［J］.Auton Neurosci，2004，110:36 －43.

7 Biswas SC，Buteau J，Greene LA.Glucagon－like peptide－1(GLP－1)diminishes neuronal degeneration and death caused by NGF deprivation by suppressing Bim induction ［J］.Neurochem Res，2008，33:1845－1851.

8 Oeseburg H，de Boer RA，Buikema H.Glucagon－like peptide 1 prevents reactive oxygen species－induced endothelial cell senescence through the activation of protein kinase A ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，30:1407 －1414.

9 Erdogdu O，Nathanson D，Sjoholm A.Exendin－4 stimulates proliferation of human coronary artery endothelial cells through eNOS－，PKA－and PI3K/Akt－dependent pathways and requires GLP－1 receptor［J］.Mol Cell Endocrino，2010，325:26 －35.

10 Jin HY，Liu WJ，Park JH，et al.Effect of dipeptidyl peptidase－ Ⅳ(DPP－Ⅳ)inhibitor(Vildagliptin)on peripheral nerves in streptozotocin－induced diabetic rats［J］.Arch Med Res，2009，40:536－544.