結直腸癌患者門靜脈血p27基因甲基化檢測及其臨床意義

陳積賢，張 潔，任振華，薛迪新，吳偉力，張仁虎，余 銘，林道浙，林 肖，黃建武，梁美珍，賀先偉，徐 平

p27蛋白是Polyak等于1994年在轉化生長因子－β(TGF－β)處理的生長抑制細胞及接觸生長抑制的細胞株中發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質量為27 kd的耐熱細胞周期抑制蛋白，是p27基因的產(chǎn)物，屬kip類，與p21、p57功能相似。新近發(fā)現(xiàn)它屬于細胞周期素 (cyclin)－周期素依賴性蛋白激酶 (CDK)抑制蛋白，能與cyclin－CDK復合物結合，控制細胞由G1期進入S期的“位點”，從而抑制細胞增殖［1］。國外學者認為p27基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，認為其抑癌作用可能是其產(chǎn)物p27蛋白在轉錄后水平以化學劑量方式與cyclin－CDK復合物，尤其是cyclin－CDK2復合物結合，阻止細胞增殖通過限制點—— “位點”的最關鍵因素，從而使細胞周期停止在G1期。但是在研究中很少發(fā)現(xiàn)有p27基因的缺失及突變。如果p27蛋白水平低下或缺失，可以導致細胞過度增殖，引起腫瘤發(fā)生。而表觀遺傳修飾方式之一的甲基化事件與基因的表達有密切聯(lián)系。所以本實驗利用MSP甲基化檢測血液標本中p27的啟動子甲基化水平改變，并探討其與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展、臨床分期、分化程度和淋巴結轉移臨床病理的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院腫瘤外科2007年2月—2009年12月手術治療的結直腸癌患者106例為研究對象。其中男63例，女43例;年齡＜60歲48例，≥60歲58例;Dukes分期:A+B期55例，C+D期51例;腫瘤部位:右半結腸16例，左半結腸32例，直腸58例;腫瘤大小:＜5 cm 67例，≥5 cm 39例;浸潤深度:未達漿膜層29例，達漿膜層77例;有淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移65例;分化程度:低分化25例，高中分化81例。選取同期健康體檢的正常者29例為對照組。

1.2 實驗方法 基因甲基化狀態(tài)分析:采用德國QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp Blood Mini KIT試劑盒提取血清。每份標本使用2.5 ml血清，按照說明書提取DNA并定量，按文獻方法略作修改進行DNA的亞硫酸氫鹽處理，針對修飾過的p27啟動子CpG島序列，分別設計甲基化、非甲基化特異引物擴增目的片段。引物序列為27M:5'－AAGA GGCGAGTTAGCGT－3;5'－AAAACGCCGCCGAACGA －3;27U:5'－ATGGAAGAGGTGAGTTAGT－3';5'－AAAACCCCAATTAAAAACA－3';反應條件:94℃，10 min預變性后接由95℃，45 s;66℃，45 s;72℃，45 s三步組成的35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物長度p27M:195 bp(堿基對)、p27U:212 bp。甲基化特異性的PCR反應體系為25μl，包括2μl的修飾DNA，1×PCR bufferII(Perkin－Elmer)，2 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L dNTP，上下游引物各1μmol/L，和1 U AmpliTaq Gold polymerase(Perkin－Elmer)，反應條件:首先95℃變性10 min，然后95℃變性30 s，特定溫度退火45 s，延長72℃，45 s，共40個擴增循環(huán)。實驗設陽性對照 (試劑盒提供)，不含DNA的蒸餾水作為陰性對照。10μl的PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，運用圖像采集與分析統(tǒng)，記錄并分析電泳結果，所有試驗均重復三次。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)均在SPSS 11.5軟件上處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 p27基因甲基化狀態(tài) 以門靜脈血為實驗材料，檢測p27基因啟動子區(qū)域的甲基化情況。甲基化特異性引物擴增的條帶則標本計為甲基化 (M)，未甲基化特異性引物擴增條帶則標本計為未甲基化 (U)，電泳結果顯示在特異引物參與下PCR擴增后的特異性片段 (見圖1)。

2.2 p27基因甲基化與結直腸癌患者臨床病理特征的關系106例結直腸癌患者中，p27基因甲基化陽性率與患者的性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤大小均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05);而p27基因甲基化陽性率與結直腸癌的浸潤深度、分化程度、Dukes分期及有無淋巴結轉移均有統(tǒng)計學意義 (p＜0.05，見表1)。

表1 結直腸癌患者門靜脈血p27基因甲基化與臨床病理的關系Table 1 Methylation level in p27 promoter and its relationship with clinical feature

2.3 兩組靜脈血中p27甲基化發(fā)生情況 外周靜脈血的p27基因甲基化檢測結果顯示:29例對照組的甲基化陽性率為3.4%(1/29)，結直腸癌患者外周靜脈血p27基因甲基化陽性率為24.5%(26/106)，兩組p27基因甲基化陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義 (χ2=6.324，p＜0.01)。結直腸癌患者門靜脈血中p27基因甲基化陽性率為30.2%(32/106)，與外周血p27基因甲基化陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=0.854，P＞0.05)。

3 討論

細胞周期調控因子是一組調節(jié)細胞增殖、分化的正負信號，它們之間的相互作用促進和抑制細胞周期的正常進程。目前越來越多的研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞周期的調控失常有關，而細胞周期調控因子的異常是重要原因。p27作為細胞周期的負調控因子，自發(fā)現(xiàn)以來一直被視為候選的抑癌基因［2－3］。p27基因是一種相對分子質量為27 kd的耐熱細胞周期抑制基因，屬kip類，與p21、p57功能相似。國外學者認為p27基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但很少發(fā)現(xiàn)有p27基因的缺失及突變，認為其抑癌作用可能是其產(chǎn)物p27蛋白在轉錄后水平以化學劑量方式與cyclin－CDK復合物，尤其是cyclin－CDK2復合物結合，阻止細胞增殖通過限制點——位點的最關鍵因素，從而使細胞周期停止在G1期［4］。p27蛋白水平低下或缺失，可導致細胞過度增殖，引起腫瘤發(fā)生。

DNA甲基化參與真核生物基因表達調控，抑癌基因的高甲基化與其失活和異常表達有關，這可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素［5－6］。近來，基因啟動子區(qū)CpG島的高甲基化引起基因失表達已成為腫瘤研究的熱點。在對多種腫瘤包括消化系腫瘤、肝癌、乳腺癌等的p27研究中，p27啟動子區(qū)域甲基化異常與腫瘤的惡性進展相關，提示p27低表達與結腸癌的進展及轉移密切相關，可作為結腸癌病理生物學行為的觀測指標。崔靜等［7］對于98例結直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)p27基因異常甲基化是p27失活的主要機制，與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。另外，乳腺癌患者檢查發(fā)現(xiàn)其組織中p27的啟動子區(qū)域存在高甲基化狀態(tài)，且有顯著性相關［8］。藥物學研究中，使用阻遏甲基化反應的藥物CdR對于胃癌細胞系增殖具有明顯的抑制作用，其可能的機制是p27基因的甲基化狀態(tài)得到了逆轉［9］。

在研究啟動子區(qū)域甲基化水平的方法中，DNA甲基化特異性PCR法具有簡便易行、靈敏度高等特點，可用于臨床少量標本的檢測，能為腫瘤的早期診斷、生物學行為及預后分析提供指導意義。

結直腸癌患者外周血p27基因甲基化水平上升，但是外周血離病灶較遠，可能存在陽性癌細胞被稀釋。為了更準確地反映p27基因甲基化與結直腸癌臨床病理特征的關系，本實驗采集了與病灶更接近的門靜脈血作為甲基化水平檢測標本。門靜脈血的甲基化陽性率與外周血無差異。本研究探討了p27基因甲基化與結腸癌生物學行為的關系，結果顯示p27基因甲基化程度與腫瘤浸潤的深度、臨床分期、惡性程度及有無淋巴結轉移有關。這些結果提示p27基因異常甲基化可能與結腸癌患者的臨床生物學行為有關，可作為判斷結直腸癌預后的參考指標。

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2 Li M，Li JY，Zhao AL，et al.Survival stratification panel of colorectal carcinoma with combined expression of carcinoembryonic antigen，matrix metalloproteinases－2，and p27 kip1 ［J］.Dis Colon Rectum，2007，50(11):1887－1898.

3 李玉華，孫煒，孫炯.卵巢上皮癌組織中p27蛋白的表達及其臨床意義［J］.中國全科醫(yī)學，2009，12(7):1211.

4 Mitti ML，Calfano D，Troncone G，et al.Complex regnlalion of the cyclin－dependent kinase inhibitor p27kipl in thyroid cancer cells by the PIJK/AKT pathway:regulatim of p27kipI expression and localization［J］.Am J Pathol，2005，166:737 －749.

5 Lindberg D，Akerstrom G，Westin G.Evaluation of CDKN2C/p18，CDKN1B/p27 and CDKN2B/p15 mRNA expression，and CpG methylation status in sporadic and MEN1－associated pancreatic endocrine tumours［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2008，68(2):271－277.

6 Auerkari EI.Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a)，p27(Kip1)and E － cadherin in carcinogenesis［J］.Oral Oncol，2006，42(1):5－13.

7 崔靜，李庚，千新來.P27基因甲基化與結直腸癌發(fā)生發(fā)展及臨床生物學行為的關系［J］.新醫(yī)學，2005，36(3):145－147.

8 蔡瑜嬌，楊樺，李鵬.p27基因啟動子甲基化在乳腺癌中的研究［J］.重慶醫(yī)學，2009，38(2):136－138.

9 王賀玲，張健，孫軍.5－Aza－CdR對胃癌細胞系BGC823生長及p27kipl基因異常甲基化的影響 ［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(1):120－121.