思密達(dá)治療潰瘍性結(jié)腸炎腹瀉的機(jī)制和療效

江學(xué)良，崔慧斐，任 晶

潰瘍性結(jié)腸炎 (ulcerativecolitis，UC)的發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前認(rèn)為UC的發(fā)病可能與腸道菌群失調(diào)、腸黏膜屏障功能缺陷、腸道通透性增高、腸道內(nèi)成分誘發(fā)的異常免疫反應(yīng)等因素有關(guān)［1］。其中，腸黏膜屏障損傷是導(dǎo)致UC腹瀉的重要原因，因此修復(fù)損傷的腸黏膜是治療UC腹瀉的關(guān)鍵措施之一［2］。

治療UC的主要藥物美沙拉嗪通過抑制炎癥間接減輕對(duì)腸黏膜屏障的損傷，而非直接修復(fù)損傷腸黏膜屏障。已有研究表明，思密達(dá)可有效修復(fù)慢性腹瀉患者腸道黏膜損傷［3］。本研究通過觀察思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療前后UC大鼠模型腹瀉癥狀改善情況及腸黏膜通透性、腸黏膜形態(tài)的變化，以期闡明思密達(dá)治療UC腹瀉的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選取封閉群健康成年Wistar大鼠80只，雌雄各半，質(zhì)量250～350 g。動(dòng)物由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料1周后，用二硝基氯苯 (DNCB)和乙酸 (AA)復(fù)合法造模［4－5］。大鼠頸背部用10%Na2S脫毛后，每天以20 g/L DNCB丙酮液滴背1次，0.3 ml/次，連續(xù)14 d。第15天用直徑3 mm的尼龍導(dǎo)管經(jīng)肛門插入結(jié)腸8 cm處，注入0.04 mmol/L(0.1%)DNCB乙醇 (50%)液0.25 ml，第16天同部位注入80 ml/L AA溶液2 ml，準(zhǔn)確定時(shí)15 s后再用5 ml 0.9%氯化鈉注射液沖洗。造模完成后1周觀察大便性狀、結(jié)腸大體形態(tài)及組織學(xué) (光鏡和電鏡)改變，符合UC表現(xiàn)即造模成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 造模成功后1周，將大鼠隨機(jī)分為兩組，每組40只。美沙拉嗪治療組 (對(duì)照組)大鼠喂服美沙拉嗪0.2 g·kg－1·d－1，8周。思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療組 (聯(lián)合治療組)大鼠喂服美沙拉嗪0.2 g·kg－1·d－1，天然蒙脫石0.6 g·kg－1·d－1，8 周。

1.3 觀察指標(biāo) 分別在治療前和治療8周后記錄腹瀉癥狀變化情況，測(cè)定腸道黏膜通透性，光鏡下觀察結(jié)腸組織學(xué)變化，電鏡下觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu)包括微絨毛變化、組織緊密連接(TJs)、上皮細(xì)胞間隙 (dilated intercellular spaces，DIS)、腸基底膜細(xì)胞核分裂相和細(xì)胞凋亡情況。

(1)腸黏膜通透性測(cè)定采用尿中乳果糖與甘露醇的比率(L/M)，L/M值增大，說明腸黏膜通透性增高。(2)結(jié)腸炎癥程度分級(jí)按以下方法:0級(jí)，無多形核細(xì)胞;1級(jí)，固有層有少量多形核細(xì)胞浸潤(rùn);2級(jí)，固有層有明顯多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，累及50%以上隱窩;3級(jí)，有大量多形核細(xì)胞浸潤(rùn)伴隱窩膿腫;4級(jí)，明顯急性炎癥伴潰瘍形成。(3)結(jié)腸組織學(xué)有效性評(píng)價(jià):完全緩解，治療后病理分級(jí)比治療前下降，治療后病理分級(jí)0～1級(jí);部分緩解，治療后病理分級(jí)比治療前下降，治療后病理分級(jí)＞1級(jí);無變化，治療前后無變化。(4)結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)觀察:取腸黏膜組織各切成1 mm×1 mm×2 mm，迅速投入4℃的3%戊二醛－1.5%多聚甲醛－0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.2)，前固定2 h以上，經(jīng)緩沖液漂洗后用1%鋨酸4℃后固定1.5 h，再漂洗后用系列乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋。經(jīng)半薄切片定位，超薄切片60 nm，用醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，置電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用Ridit分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉癥狀改善情況 治療后，聯(lián)合治療組大鼠腹瀉癥狀恢復(fù)正常時(shí)間較對(duì)照組顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見表1)。

表1 兩組大鼠治療后腹瀉癥狀改善時(shí)間比較，d)Table 1 The comparsion of diarrhea recovery time of rats after treatment in two groups

表1 兩組大鼠治療后腹瀉癥狀改善時(shí)間比較，d)Table 1 The comparsion of diarrhea recovery time of rats after treatment in two groups

組別 例數(shù) 腹瀉次數(shù)恢復(fù)正常時(shí)間黏液膿血便40 15.8±3.2 16.6±3.7聯(lián)合治療組 40 9.9±4.8 11.6±6.2 t消失時(shí)間對(duì)照組9.15 6.19 P值值＜0.05 ＜0.05

2.2 腸黏膜通透性改變情況 治療前兩組大鼠尿中L/M值間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);而治療后聯(lián)合治療組大鼠尿中L/M值較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見表2)。

表2 思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療UC大鼠尿中乳果糖與甘露醇的比率，%)Table 2 The ratio of lactulose admannitol in urine after treatment withSmecta and Mesalazine

表2 思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療UC大鼠尿中乳果糖與甘露醇的比率，%)Table 2 The ratio of lactulose admannitol in urine after treatment withSmecta and Mesalazine

40 44.8±5.2 35.6±4.7聯(lián)合治療組 40 45.9±5.8 28.6±4.2 t組別 例數(shù) 治療前 治療后對(duì)照組1.26 9.93 P值值＞0.05 ＜0.05

2.3 大鼠組織學(xué)緩解情況 治療后對(duì)照組大鼠組織學(xué)完全緩解28例，部分緩解10例，無變化2例;聯(lián)合治療組完全緩解38例，部分緩解2例，無緩解0例。聯(lián)合治療組大鼠組織學(xué)緩解情況顯著好于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (u=8.22，p＜0.05)。

2.4 超微結(jié)構(gòu)改變 UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為微絨毛稀疏、紊亂、斷裂乃至脫落;線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核固縮;核染色體邊集明顯;可見清晰的凋亡小體，杯狀細(xì)胞明顯減少，殘留的杯狀細(xì)胞水腫明顯，線粒體腫脹、嵴突減少、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療后4周，線粒體腫脹減輕，微絨毛和杯狀細(xì)胞恢復(fù)正常，凋亡細(xì)胞顯著減少;治療后6周，結(jié)腸上皮細(xì)胞微絨毛完整，細(xì)胞連接和細(xì)胞器未見損傷。而單純應(yīng)用美沙拉嗪治療8周后，大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)才完全恢復(fù)正常。聯(lián)合治療組和對(duì)照組大鼠結(jié)腸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常時(shí)間分別為 (35.8±6.2)d和 (52.0±8.7)d，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=8.71，P ＜0.05)。

3 討論

腸黏膜屏障損傷是導(dǎo)致UC腹瀉的重要原因［6］。腸黏膜屏障是指正常腸道具有較為完善的功能隔離帶，可將腸腔與機(jī)體內(nèi)環(huán)境分隔開來，防止致病性抗原 (腸腔內(nèi)的細(xì)菌、有毒物質(zhì)、食物抗原物質(zhì)、致癌物質(zhì)等)侵入的功能，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定，維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)。腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障組成。腸道機(jī)械屏障由腸黏膜表面的黏液層、腸上皮本身及其緊密連接、上皮基底膜、黏膜下固有層等組成。細(xì)胞連接是多細(xì)胞生物中細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的一些特化的連接裝置，是腸道機(jī)械屏障的重要組成部分，它們對(duì)機(jī)體的構(gòu)建和功能都十分重要。腸上皮緊密連接一旦發(fā)生變異、減少或缺失，腸上皮細(xì)胞間隙通透性就會(huì)增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子物質(zhì)可通過緊密連接進(jìn)入體循環(huán)。UC的特征就是腸上皮細(xì)胞旁路通透性增高，允許腸腔內(nèi)病原菌及其毒素通過并進(jìn)入上皮下層，這是導(dǎo)致炎癥反復(fù)發(fā)作的重要原因［7］。檢測(cè)活動(dòng)期UC腸黏膜組織，在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域的與緊密連接相關(guān)的蛋白表達(dá)均明顯下降，非中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的區(qū)域蛋白表達(dá)無明顯改變。蛋白表達(dá)降低，可能與活動(dòng)期UC細(xì)胞側(cè)滲透性增加有關(guān)。UC有反復(fù)發(fā)作的腹瀉，腹瀉與腸道急性炎癥和慢性損害區(qū)域黏膜上皮細(xì)胞側(cè)膜滲透性增加有關(guān)。對(duì)UC結(jié)腸組織的研究表明，炎癥的結(jié)腸黏膜屏障功能減弱，緊密連接結(jié)構(gòu)的改變是原因之一［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為微絨毛稀疏、紊亂、斷裂乃至脫落;線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核固縮;核染色體邊集明顯;可見清晰的凋亡小體，杯狀細(xì)胞明顯減少，殘留的杯狀細(xì)胞水腫明顯，線粒體腫脹、嵴突減少、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。提示腸黏膜屏障損傷是UC腹瀉重要原因。

如何修復(fù)損傷的腸黏膜是治療UC腹瀉的關(guān)鍵措施之一?，F(xiàn)有治療UC的主要藥物，如美沙拉嗪通過非特異性抗炎作用，間接減輕炎癥對(duì)腸黏膜屏障損傷，但不能直接修復(fù)腸黏膜屏障。因此，聯(lián)合直接修復(fù)腸黏膜藥物有可能更迅速和長(zhǎng)久緩解UC慢性腹瀉的癥狀。研究表明，思密達(dá)可以直接修復(fù)損傷腸黏膜［9］，因?yàn)樗济苓_(dá)是由雙四面體氧化硅，單八面體氧化鋁組成的多層結(jié)構(gòu)，其特殊結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的表面積 (約100 m2/g)，對(duì)腸黏膜有很強(qiáng)的覆蓋能力，粘附于整個(gè)腸腔表面，具有極高的定位能力，對(duì)細(xì)菌、病毒及其毒素等攻擊因子具有強(qiáng)大的吸附作用，使其失去致病能力，并能覆蓋消化道黏膜與黏液蛋白結(jié)合，增強(qiáng)黏膜屏障，阻止病源微生物的攻擊，從而具有保護(hù)損傷的腸黏膜;思密達(dá)能抑制腸道致病菌的傳播，保護(hù)腸黏膜免受由致病菌感染引起的組織學(xué)變化，同時(shí)它能使腸黏膜凝膠增厚、黏液增多，并延緩黏液的生存時(shí)間，維護(hù)腸道正常分泌，減少水電解質(zhì)流失，增強(qiáng)腸黏膜的屏障作用。因此，它能消除病原，起到止瀉的作用，且思密達(dá)不經(jīng)腸道吸收入血，故安全無毒副作用。已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明，思密達(dá)對(duì)各種類型的腹瀉，包括成人與兒童、細(xì)菌感染與非細(xì)菌感染、急性與慢性腹瀉均有很好的療效，適用于多種類型的腹瀉［10－12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療UC，較單純應(yīng)用美沙拉嗪治療能更快修復(fù)損傷腸黏膜屏障，使線粒體腫脹減輕，微絨毛和杯狀細(xì)胞恢復(fù)正常，凋亡細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞連接恢復(fù)正常，從而快速緩解腹瀉癥狀。另外，腸道對(duì)大分子物質(zhì)的通透性試驗(yàn)是評(píng)估腸道黏膜屏障功能的方法之一。腸道對(duì)大分子物質(zhì)的通透性增加，意味著腸道結(jié)構(gòu)有變化，腸屏障功能的損害，腸道內(nèi)的細(xì)菌或毒素有可能通過腸道黏膜屏障進(jìn)入血循環(huán)。因?yàn)楦事洞挤肿虞^小，可以通過絨毛細(xì)胞間緊密連接，主要反映絨毛細(xì)胞間緊密連接的通透性，而乳果糖分子直徑較大，主要通過腺管細(xì)胞間緊密連接被吸收，故主要反映腺管細(xì)胞間緊密連接的通透性，因此，二者聯(lián)合應(yīng)用，測(cè)定尿中L/M值可間接但全面、準(zhǔn)確地反映腸黏膜的通透性變化［13］。L/M值增大，說明UC腸通透性增高，腸屏障功能損害。思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療后，L/M值顯著低于單純應(yīng)用美沙拉嗪治療，表明思密加強(qiáng)了腸黏膜屏障功能。

總之，思密達(dá)聯(lián)合美沙拉嗪治療UC腹瀉，既可以通過美沙拉嗪抗炎作用減輕腸黏膜損傷，又可以通過思密達(dá)直接修復(fù)損傷腸黏膜，從而有望達(dá)到迅速長(zhǎng)久止瀉的作用。由于UC患者腸黏膜屏障的各個(gè)環(huán)節(jié)都存在不同程度的損傷，將腸黏膜屏障修復(fù)作為治療UC新策略，將為UC治療提供新的思路［14－16］。

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