拉曼光譜-區(qū)段相似度法用于降糖類藥物的快速檢測

劉 暢,張中湖,柳 艷,陸 峰*

(1.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部,上海 200433;2.山東省藥品檢驗所,濟南 250012;3.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室,上海 200433)

假藥、劣藥嚴重危及人們的健康和生命[1]。傳統(tǒng)的假藥檢測方法如化學法、薄層色譜法、液相色譜及聯(lián)用技術[2]均需破壞樣品,且耗時較長,難以滿足實際工作對藥品快速檢測的需求,而便捷、快速、無破壞的光譜方法,如近紅外光譜、紅外光譜、拉曼光譜等[3]正好可以滿足這一需求。拉曼光譜法對樣品進行無損分析,具有測試樣品非接觸性、非破壞性,檢測靈敏度高、時間短、樣品需求量小等特點,近年來已成為假藥、劣藥快速檢驗的新寵[4]。

在分析過程中,拉曼光譜法通常還需要借助大量的藥品光譜分析模型或光譜數(shù)據(jù)庫[5]才能實現(xiàn)判別。本文采用OPUS軟件自帶的快速相似度檢測(Quick Identity Test)模塊,以幾種降糖藥及輔料分別模擬的真、假藥為工具樣品,不借助分析模型或光譜數(shù)據(jù)庫,僅需用待測品和相應對照品各一張光譜信息,經(jīng)過選取適宜的多區(qū)段計算其Hit Quality值[6],對樣品中可能存在的成分進行快速檢測。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和樣品 儀器為必達泰克i-Raman系列BWS415-785H型拉曼光譜儀。光譜范圍為175～3 200 cm-1,分辨率為3 cm-1。熱電制冷控溫裝置和2048像素的電荷耦合元件(CCD)檢測器。

格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、吡格列酮、那格列奈、阿卡波糖對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。樣品中包括市售不同廠家和批號的6類共42種降糖藥(均為片劑),以及12種常用輔料(包括L-羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮-PVPL30、淀粉、糊精、滑石粉、羥丙基甲基纖維素、乳糖、羥甲基淀粉、微晶纖維素、硬脂酸鎂、預膠化淀粉和蔗糖)均由山東省藥品檢驗所提供。

1.2 采集光譜 分別測定6種對照品和42種藥片及12種輔料的拉曼光譜(藥片去除包衣,刮除表面后采集光譜),激發(fā)光波長785 nm,積分時間5 s。6種降糖藥主藥成分對照品的拉曼光譜見圖1。

圖1 6種降糖藥對照品的拉曼光譜圖Figure 1 Raman spectra photograms of reference standards of six hypoglycemic drugs

1.3 數(shù)據(jù)處理 將格列本脲、格列齊特和格列吡嗪分別兩兩進行排列組合,搜索其特征譜段。截取198～ 376 cm-1、773 ～1068 cm-1、1 225 ～1 370 cm-1、1 507～1 666 cm-14個波數(shù)段,設定平滑系數(shù)為13,采用二階導數(shù),計算其Hit Quality值并作散點圖。將這些參數(shù)全部用于6類42種降糖藥和12種常用輔料拉曼光譜的Hit Quality值運算。

2 結 果

本研究模擬的假藥體系是用一種降糖藥物來分別“冒充”其他5種降糖藥物作為研究對象,針對6種對照品與42個樣品進行Hit Quality值的運算。通過改變Quick Identity Test方法中的各項參數(shù),使真藥樣品與假藥樣品(輔料或“冒充”高價藥的低價藥)得以更好的分離,結果見圖2。其中,真藥樣品與假藥樣品的判別分界點可根據(jù)觀察而設定,即各個藥的分界點均不同,那格列奈片、阿卡波糖片、格列齊特片、格列吡嗪片、格列本脲片、吡格列酮片的判別分界點分別為 1.0、0.8 、1.2 、1.2 、1.3 、1.1 。

3 討 論

圖2 6種降糖藥對照品為參考譜的Hit Quality值散點圖Figure 2 Distribution diagrams of the Hit Quality values calculated based on the reference standards of six hypoglycemic drugs

3.1 全譜計算相似度法與區(qū)段相似度法的比較 以全譜計算相似度的操作盡管比較簡單,但大量冗余光譜信息降低了Hit Quality值的抗干擾能力(“拉平效應”),使得計算結果的準確度降低,如本研究原先采用全譜波數(shù)范圍(200～1 700 cm-1)計算Hit Quality值時,只能大致分開4種藥物,假陽性率和假陰性率都較高。因此,以區(qū)段相似度法判定藥物真假時,對區(qū)段的選擇是關鍵所在,選擇特征性強的一個或多個光譜區(qū)段(相當于多個局部相似度的加權),可以提高計算結果的準確度,同時減少計算量。由圖1可見,格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、吡格列酮、那格列奈、阿卡波糖6種標準品的光譜在許多峰位處的峰型十分相似,有很多峰位重合,較難區(qū)分開。要使Hit Quality值在不同藥物之間區(qū)分得更加完全,可通過優(yōu)選藥品主藥成分對照品相互獨立且表征各化合物結構特征的光譜區(qū)段,使該方法的檢測效果達到比較滿意的程度。截取的特征區(qū)段范圍太寬或太窄都可能會影響分離結果。截取的區(qū)段范圍太寬,區(qū)段內(nèi)的特征、非特征散射峰并存,達不到很好的區(qū)分效果。截取的區(qū)段范圍太窄,特征散射峰偏少,相互之間比較時差異小,體現(xiàn)不出Hit Quality值的區(qū)分度。本研究綜合考慮各藥片特征區(qū)段后,最終選擇格列齊特片與格列吡嗪片的拉曼散射譜中相互間差異最大的4個區(qū)段(198～376 cm-1、773～ 1068 cm-1、1 225～1 370 cm-1、1 507～1 666 cm-1),而這4個區(qū)段正好也是其他幾種藥物差異相對較大的特征區(qū)段,可以得到相對最佳的結果,將6種藥物基本分開。

3.2 平滑點與導數(shù)階數(shù)的影響 平滑點與導數(shù)階數(shù)也是區(qū)段相似度法的重要選擇參數(shù)。平滑降低噪音但也使信號失真。OPUS軟件提供的的平滑點可選值為5～25,平滑系數(shù)太大會使圖譜中許多小的特征散射峰消失,不利于特征區(qū)段的截取;平滑系數(shù)太小則會使圖譜中許多小的特征散射峰過多,無端增加特征區(qū)段截取與選擇的工作量。本研究優(yōu)選的平滑點數(shù)為 13,效果優(yōu)于 9、11、15、17點等平滑。OPUS軟件使用Savitzky-Golay算法求光譜的一至五階導數(shù),其中一階導數(shù)可以消除線形干擾吸收,常用于加強那些較寬背景中的明顯但較弱的譜段;二階導數(shù)則進一步增強了這種效果且能使光譜的信息特征細節(jié)放大。本研究最終選擇二階導數(shù)。

3.3 方法學評價 方法學評價考察了區(qū)段相似度法的4個指標——靈敏度、專屬性、陰性預報性及檢出效率(見表1)。對于化學藥品假藥的快速檢測來說,一個合適的初篩方法應盡量使所檢測的樣品有足夠高的專屬性,即達到較低的假陽性率以實現(xiàn)低漏檢率,同時兼顧較低的假陰性率,降低后續(xù)篩選的工作量。從專屬性來看,區(qū)段相似度法中分別以那格列奈、阿卡波糖、格列齊特、格列本脲和格列吡嗪為對照品,計算得到的專屬性指標達到了100%,沒有出現(xiàn)假陽性結果;而以吡格列酮為對照品的計算出現(xiàn)了1個假陽性結果,專屬性有所下降,為98%。在靈敏度和陰性預報性方面,以那格列奈和阿卡波糖為對照品沒有出現(xiàn)假陰性結果,靈敏度和陰性預報性結果均達到了100%;而其他4種降糖藥稍遜,以格列齊特為對照品的計算分別出現(xiàn)了1～2個假陰性樣品,靈敏度和陰性預報性均有所降低。在檢出效率方面,那格列奈和阿卡波糖達到了100%,所有結果與實際樣品相符的檢測率最高;格列齊特、格列本脲、格列吡嗪和吡格列酮的檢出效率分別為98.15%、96.30%、98.15%和 96.30%。

表1 區(qū)段相似度法計算結果的效能評價Table 1 Efficacy evaluation of results calculated with the segmented similarity method

總體來看,那格列奈和阿卡波糖的假陽性率和假陰性率均為零,漏檢率為零,結果最優(yōu);格列齊特、格列本脲和格列吡嗪的假陽性率為零,假陰性率分別為8.33%、16.67%和20%,有一部分真藥會被誤認為假藥,這可以在進一步更細致的藥檢工作中檢測出來;吡格列酮的假陽性率較高,假藥漏檢率較大,這可能與這種藥物的結構特征區(qū)段不明顯有關,說明拉曼光譜-區(qū)段相似度法以及本研究優(yōu)選的實驗條件參數(shù)還有待進一步優(yōu)化。

拉曼光譜-區(qū)段相似度法為藥品快速檢測提供了一種簡便易用的方法。隨著對更大批量的真實、未知樣品的分析研究工作的展開,將進一步增加此項研究工作的現(xiàn)實意義。

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