TBT對(duì)青春期雌性SD大鼠卵巢結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌的影響

熊萬(wàn)軍 蘇小霞

重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,重慶市萬(wàn)州區(qū) 404020

三丁基錫(tributyltin)是有機(jī)錫類化合物的一種,為一種具有類似于雄激素的內(nèi)分泌干擾物[1]。三丁基錫主要是作為木材防腐劑、聚氯乙烯塑料制品的熱穩(wěn)定劑、工業(yè)用冷凝水的滅菌劑和作為殺蟲(chóng)劑添加到涂料中涂于船體表面[2]。由于工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用,從各種工業(yè)廢水及涂料中釋放入水體的TBT則會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。不僅毒害水生生物破壞生態(tài)環(huán)境,而且不可忽視的是它們可在食用水生生物機(jī)體內(nèi)富集,被人食用后對(duì)人體造成危害[3]。自從發(fā)現(xiàn)有機(jī)錫化合物對(duì)海洋的污染以來(lái),有機(jī)錫被認(rèn)為是迄今為止由人為因素而導(dǎo)致大量進(jìn)入海洋環(huán)境中的毒性最大的化學(xué)品之一。有研究表明,三丁基錫可使海洋動(dòng)物性成熟和繁殖推遲,貝類和腹足綱動(dòng)物性畸變[4];對(duì)人的腎、肝、膽、呼吸系統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均有不同程度的毒性作用[5],并具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,其中對(duì)細(xì)胞凋亡的干擾,作為十分重要和典型的細(xì)胞毒性的體現(xiàn),已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前三丁基錫類的相關(guān)研究主要集中在其對(duì)海洋生物的生殖發(fā)育影響,對(duì)哺乳動(dòng)物尤其是對(duì)青春期哺乳動(dòng)物的影響研究涉及很少。本研究選擇氯化三丁基錫(tributyltin chloride,TBT)為研究對(duì)象,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索TBT對(duì)青春期雌性SD大鼠卵巢及內(nèi)分泌的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康21日齡雌SD大鼠60只,體重40～50g。

1.2 主要試劑、儀器 TBT純度≥98%(南通虹鼎國(guó)際化工公司);睪酮(T)放射免疫測(cè)定試劑盒(天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司);雌二醇(E2)放射免疫測(cè)定試劑盒,DAB試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司),SP-9000免疫組化染色試劑盒(美國(guó)ZYMED公司);食用玉米油(四川嘉里糧油工業(yè)有限公司);SN-695A型放射免疫分析儀(上海日環(huán)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品),石蠟切片機(jī)為德國(guó)Leica公司的產(chǎn)品,電子天平為上海精天電子儀器有限公司的產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組及染毒方法 21日齡雌性SD大鼠60只,經(jīng)2d適應(yīng)性飼養(yǎng)后,將大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、0.5mg/kg染毒組、2.5mg/kg染毒組、5.0mg/kg染毒組、7.5mg/kg染毒組和 10.0mg/kg染毒組。每組有大鼠10只,各組都與玉米油配成相應(yīng)的溶液,按0.4%體重灌胃,對(duì)照組用同樣體積的玉米油灌胃。每天均在上午9:00～10:00進(jìn)行灌胃,染毒期為30d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠均飼以普通飼料,自由飲水,每天稱重1次。

1.4 樣本的處理及指標(biāo)的觀察

1.4.1 激素的測(cè)定:在染毒30d結(jié)束后第2天準(zhǔn)備采集標(biāo)本,先稱量每只大鼠的體重,在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行眼眶動(dòng)脈采血,將血樣放入37℃水浴箱中水浴30min,然后以2 500r/min離心10min后,取上層血清放入-20℃冰柜中待用。應(yīng)用放射免疫法測(cè)定大鼠血清T、E2的濃度。

1.4.2 卵巢組織的采集:將采血的大鼠斷頭處死,取出卵巢,用電子天平稱重后,將卵巢用生理鹽水清洗后,經(jīng)4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,切片,作HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)改變。

2 結(jié)果

2.1 卵巢臟器系數(shù)的測(cè)定 染毒30d后,各劑量組與對(duì)照組的臟器系數(shù)變化見(jiàn)表1,不同劑量組卵巢臟器系數(shù)的變化規(guī)律見(jiàn)圖1。

表1 不同劑量組卵巢臟器系數(shù)的變化( ±s)

表1 不同劑量組卵巢臟器系數(shù)的變化( ±s)

注:*與對(duì)照組相比,P＜0.05;#與0.5mg/kg、2.5mg/kg組相比,P＜0.05。

不同劑量組對(duì)照組 0.5mg/kg 2.5mg/kg* 5.0mg/kg 7.5mg/kg# 10.0mg/kg卵巢臟器系數(shù) 0.022±0.001 0.023±0.002 0.028±0.002 0.032±0.003 0.042±0.001 0.034±0.001

圖1 不同劑量組臟器系數(shù)的變化

由此可見(jiàn),隨著TBT染毒劑量的增加,卵巢臟器系數(shù)有逐漸增加的趨勢(shì)(圖 1),7.5mg/kg、10.0mg/kg卵巢臟器系數(shù)明顯高于對(duì)照組和0.5mg/kg、2.5mg/kg組(P ＜0.05),在 10.0mg/kg組劑量組中卵巢臟器系數(shù)卻又出現(xiàn)回落現(xiàn)象。

2.2 血清激素的測(cè)定 染毒30d后,各劑量組和對(duì)照組血清T、E2的濃度變化見(jiàn)表2,不同劑量組T、E2的變化規(guī)律見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同劑量組T濃度變化

圖3 不同劑量組E2 濃度變化

表2 不同劑量組的血清T和E2濃度比較()

表2 不同劑量組的血清T和E2濃度比較()

注:*與對(duì)照組相比,P＜0.05;#與0.5mg/kg組相比P＜0.05。

項(xiàng)目不同劑量組對(duì)照組 0.5mg/kg 2.5 mg/kg 5.0mg/kg 7.5 mg/kg 10mg/kg T(pmol/L) 13.811±1.206 9.897±0.859* 8.248±0.485* 7.326±0.285 6.246±0.751 5.701±1.101*E2(mu/ml) 0.575±0.081 0.439±0.063* 0.310±0.071 0.270±0.235 0.118±0.021* 0.052±0.014#

以上分析顯示,隨著 TBT染毒劑量的增加,血清T的濃度逐漸增高,7.5mg/kg、10.0mg/kg組血清T的濃度高于對(duì)照組和0.5mg/kg、2.5mg/kg組(P＜0.05),而血清E2的濃度隨著染毒劑量的增加而降低,7.5mg/kg、10.0mg/kg組低于對(duì)照組和0.5mg/kg、2.5mg/kg組(P＜0.05)。T的濃度與TBT劑量呈正相關(guān)(r=0.873,P＜0.05),E2的濃度與TBT的劑量成負(fù)相關(guān)(r=0.902,P＜0.05),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 卵巢組織學(xué)改變 對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)多個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的卵泡,原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡及成熟卵泡的數(shù)量及形態(tài)正常,顆粒細(xì)胞多層,排列整齊,染色質(zhì)致密,卵泡膜細(xì)胞1～2層(圖 4)。0.5mg/kg、2.5mg/kg組開(kāi)始出現(xiàn)閉鎖卵泡增多,生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量減少,卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層減少,排列疏松,卵泡膜-間質(zhì)細(xì)胞增生。5.0mg/kg組上述情況加重,黃體增生,細(xì)胞排列呈條狀,部分血管破裂(圖 5)。7.5mg/kg、10.0mg/kg組中,黃體增生更明顯,部分黃體細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變化,卵泡數(shù)量減少明顯,卵母細(xì)胞消失,卵泡膜細(xì)胞明顯增生(圖6、7)。

圖4 正常卵巢組織HE×200

圖5 染毒劑量5.0mg/kg 組,卵巢組織 HE×200

圖6 染毒劑量7.5mg/kg 組,卵巢組織 HE×200

圖7 染毒劑量10mg/kg組, 卵巢組織 HE×200

3 討論

卵巢中激素合成中氧化、羥化和脫氫酶活動(dòng)過(guò)程都在細(xì)胞漿的粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行。卵巢組織一般直接吸取血液中的膽固醇作為合成性激素的基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)顯示TBT實(shí)驗(yàn)組血清睪酮的濃度隨著染毒劑量的增加而增加,而血清雌二醇的濃度隨染毒劑量的增加而減少,均呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,而HE染色顯示隨著染毒劑量的增加,卵巢功能結(jié)構(gòu)改變比較明顯,閉鎖卵泡增多,卵泡的顆粒層減少,黃體出現(xiàn)空泡樣改變。按照常規(guī),因?yàn)槁雅輸?shù)量的減少,結(jié)構(gòu)功能的嚴(yán)重破壞,黃體的功能結(jié)構(gòu)的破壞,血清睪酮的改變應(yīng)該與雌二醇的改變是同行的,但結(jié)構(gòu)顯示確呈相反樣的改變,這說(shuō)明了TBT抑制 T轉(zhuǎn)化為雌酮及雌二醇的功能,并且隨著染毒劑量的增大,這種抑制進(jìn)一步加重。Ema等[6]研究顯示有機(jī)錫化合物抑制豬睪丸中睪酮合成過(guò)程中17β-HSD酶的活性。TBT使睪酮分解代謝過(guò)程的酶,如5α還原酶,P450芳香化酶的活性減弱[7]。另外,體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),睪酮誘導(dǎo)或促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,雌二醇則反之[8]。由此可以推測(cè)血清睪酮與雌二醇的改變趨勢(shì)可能是由于 TBT干擾了這些關(guān)鍵酶的代謝所致。

本研究顯示,隨著染毒劑量的增加,卵巢臟器系數(shù)存在增加的趨勢(shì),7.5mg/kg組的臟器系數(shù)明顯高于對(duì)照組。臟器系數(shù)可直接反映臟器是否有增生、充血、水腫或萎縮。實(shí)驗(yàn)組臟器系數(shù)的增加可能是TBT作用使卵巢的增生或者是水腫所致,在10.0mg/kg劑量組中,臟器系數(shù)出現(xiàn)回落趨勢(shì),可是是因?yàn)榘l(fā)生萎縮變性所致。膜細(xì)胞合成的雄激素透過(guò)基膜進(jìn)入顆粒細(xì)胞,在芳香化酶系的作用下雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?。?dāng)芳香化酶的活性降低時(shí),雄激素的轉(zhuǎn)化受到影響,含有雄激素的類固醇不能順利排出,從而影響到卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境,導(dǎo)致了卵細(xì)胞凋亡,卵巢功能的降低,重量的減輕。

綜上所述,TBT能夠?qū)е麓笫舐殉驳姆置诤蜕彻δ艿恼系K,且存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。影響的機(jī)制可能是TBT首先抑制了芳香化酶的活性,使卵巢分泌的雄激素不能轉(zhuǎn)化為雌激素,從而使雄激素的濃度過(guò)高,雌激素的濃度過(guò)低,干擾了大鼠的內(nèi)分泌功能,導(dǎo)致了卵泡的發(fā)育障礙,促進(jìn)了卵泡的凋亡,從而影響了卵巢的形態(tài)和功能。

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