水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測方法研究

吳金男，王玉婷

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）來源于藍藻，對人和水生動植物具有很強的毒性及潛在危害，目前的環(huán)境檢測已經(jīng)把其列為其中的一個指標，但是如何既能準確又能迅速地定性定量檢測出是人們普遍關注的問題.MC是一類單環(huán)七肽毒素，至今已發(fā)現(xiàn)60多種異構體[1]，其化學結構中一個特殊的氨基酸側鏈——Adda（5位）是微囊藻毒素活性所必需的，而2、4位取代基不同和空間結構上的微小差異將導致毒性上的較大差別.水體中最常見的微囊藻毒素是MC-RR、MC-YR、MC-LR，其中MC-LR毒性大于MC-RR、MC-YR[2].世界衛(wèi)生組織（WHO）和我國的飲用水標準規(guī)定，MC-LR的含量不得超過1.0 g/L[3，4].目前水體中MC的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[5-8]和酶聯(lián)免疫法[9，10]等，其中以HPLC法應用最為普遍[11，12].

隨著太湖水域藍藻水華的頻繁爆發(fā)，微囊藻毒素對環(huán)境和人類健康的潛在影響已越來越受到關注.HPLC其樣品前處理步驟較為繁瑣，費時較長.本文通過樣品處理步驟簡化后的HPLC對水產(chǎn)品中富集的微囊藻毒素進行檢測，建立水產(chǎn)品中微囊藻毒素的測定方法.

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：黑色大頭鰱魚，體重2.5 kg，購于常熟市水產(chǎn)市場，用于富集微囊藻毒素.

主要試劑：微囊藻毒素MC-LR，MC-RR標準品（購自美國Sigama公司），粗毒素（由藍藻干制藻粉中用甲醇提取的粗提毒素），甲醇（色譜純），甲醇（分析純），乙酸，正丁醇，正己烷等.

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（1100 series Agilent），超聲波清洗器（KQ-600E，昆山市超聲儀器有限公司），離心機（Biofuge stratos SORVALL.USA），旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000，上海亞榮生化儀器廠），SPEC18固相萃取柱（美國WATERS公司），氮吹儀（Organomation Associates Jnc），移液槍200 μL/1mL/5mL（dragon-med），電子精密天平（AR1530，奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司）

1.3 實驗方法

1.3.1 高效液相色譜檢測條件及流動相的選擇

高效液相色譜儀為Agilent 1100系列，使用C18反相色譜柱，柱溫40℃，進樣時間20 min，波長238 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μl[13].選擇甲醇水溶液及添加0.05%三氟乙酸的甲醇水溶液作為流動相.

1.3.2 樣品準備

將購買的大頭鰱魚洗凈，魚肉片取上下兩片，脊柱、魚鰭、魚尾、魚刺均棄去不用.洗凈切丁，放入攪拌機內(nèi)，攪碎成肉漿狀.將打碎魚肉肉漿分裝在25個樣品袋中，冷藏待用.

1.3.3 樣品前處理條件的選擇及樣品檢測

稱取魚肉肉漿約5 g于離心管中，用溶劑直接提取毒素.另外在樣品中人為添加毒素，再用溶劑提取毒素.每管中添加粗毒素（7 mg/L～8 mg/L）1 mL，溶劑15 mL，振蕩，攪拌，超聲15 min.接著12000 r/min離心12 min，收集上清液.共重復3次.提取微囊藻毒素的溶劑分別為5%乙酸溶液（v/v），75%甲醇溶液（v/v），丁醇-甲醇-水溶液（v/v/v=1∶4∶15）.其中，5%乙酸提取上清液直接過SPEC18柱；75%甲醇提取上清液，旋蒸，去甲醇；正丁醇-甲醇-水（1∶4∶15）提取上清液，移入分液漏斗中，加15 mL正己烷，振蕩分層，取水相.

提取液過柱，每個小柱先用5 mL甲醇潤洗，然后用5 mL單蒸水潤洗，上樣，2 mL單蒸水洗脫，再用2 mL 20%甲醇洗脫，最后用4 mL 80%甲醇洗脫，收集于5 mL玻璃定量管中，得到藻毒素甲醇溶液.將所得溶液過0.2 μm有機系濾頭，取濾液待測.用HPLC對樣液進行測定.

由于魚體樣品生活水域非藍藻高發(fā)區(qū)，其中毒素含量可能極低，故在實際樣品檢測中，分別進行了本底樣品、添加粗提純毒素樣品、純粗毒素的毒素含量檢測.

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

在魚肉中加入毒素，用75%甲醇超聲提取15 min，離心取上清液，旋蒸去甲醇，得到粗毒素的魚肉樣品提取液.選擇甲醇水溶液以及添加0.05%三氟乙酸的甲醇水溶液作為分離微囊藻毒素的流動相.結果表明，添加0.05%三氟乙酸的55%甲醇作為流動相，能得到特征峰最大出峰面積、特征峰與雜質(zhì)峰分離程度最顯著，出峰效果最好.

圖1 55%的甲醇流動相出峰圖

2.2 標準曲線制作

用甲醇（色譜純）溶解MC-LR和MC-RR并等量混合.混合標準毒素溶液繼續(xù)用甲醇（色譜純）稀釋，配制濃度分別為10.00 mg/L、5.00 mg/L、2.00 mg/L、1.00 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L的混合標準毒素溶液，在液相色譜條件下測定，以進樣濃度與相對應的峰面積進行線性回歸，考察其相關系數(shù).每個濃度做兩個平行進樣.檢測結果見表1，標準曲線見圖2和圖3.

結果表明，進樣濃度與特征吸收峰面積在0.25 mg/L～2.00 mg/L間具有線性關系.由進樣濃度0.25 mg/L到2.00 mg/L制作的標準曲線，MC-LR和MC-RR兩種毒素的進樣濃度與相對應的峰面積呈線性關系，相關系數(shù)R2均達到0.999.

2.3 穩(wěn)定性、重復性試驗

為衡量儀器的平行進樣穩(wěn)定性，試驗中選取2 mg/L濃度毒素標品進行六次平行進樣.結果表明，MC-RR、MC-LR平行進樣相對標準偏差分別為2%、5%，說明使用的儀器具有較好的平行進樣穩(wěn)定性.

2.4 微囊藻毒素提取溶劑的選擇

相對于天然水體或飲用水而言，魚肉樣品的基質(zhì)要復雜得多.在樣品基質(zhì)中除了含有藻毒素外，還含有大量的蛋白、脂肪等雜質(zhì)，難以采用水體中微囊藻毒素檢測方法的樣品處理方法[4，5]，在樣品提取過程中必須盡可能地除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì).為了獲得理想的提取率和凈化效果，試驗中觀察了5%乙酸溶液（v/v），75%甲醇溶液（v/v），丁醇-甲醇-水溶液（v/v/v=1∶4∶15）提取微囊藻毒素的效果.

表1 MC-RR、MC-LR毒素標品進樣結果

圖2 MC-RR標準曲線

圖3 MC-LR標準曲線

由于5%乙酸溶液提取上清液中含大量膠狀粘液物質(zhì)，堵塞SPEC18柱，導致富集過程無法進行，該提取劑舍去不用.其他樣液注入高效液相色譜儀進樣口，經(jīng)流動相在C18反相萃取柱上萃取分離，得樣品出峰圖.

分析出峰結果，本底樣品中毒素含量低于儀器檢測限，無法檢出.添加毒素樣品中，75%甲醇，正丁醇-甲醇-水（1∶4∶15）提取劑都表現(xiàn)出較好的雜質(zhì)分離效果，其中，75%甲醇提取劑對應特征峰面積較大，表明所得提取液中毒素含量高，是最佳提取溶劑.

2.5 樣品檢測

表2 微囊藻毒素標品平行進樣結果（進樣濃度2 mg/L）

在實際樣品檢測中，分別對本底樣品、添加粗提純毒素樣品以及純粗毒素樣品的毒素含量檢測.

2.5.1 本底樣品和添加毒素樣品的檢測

結果（見表3、圖6～圖8）表明，本底樣品中毒素含量低于高效液相色譜儀檢測下限，故待測樣品中毒素含量忽略不計.

表3 添加毒素樣品進樣檢測結果

由于樣品最初添加1 mL毒素，最終用4 mL甲醇收集，被稀釋了4倍，故回歸到最初濃度需將得到的濃度擴大4倍.

根據(jù)標準曲線，由MC-RR、MC-RR峰面積得到其相應濃度.

MC-RR標準曲線方程:Y=68.179X－19.81（Y:峰面積，X:進樣濃度/mg·L-1）.

MC-LR標準曲線方程:Y=31.508X－9.4648（Y:峰面積，X:進樣濃度/mg·L-1）.

圖4 7 5%甲醇提取劑提取添加毒素樣品中毒素出峰圖

圖5 正丁醇-甲醇-水（1：4：15）提取劑提取添加毒素樣品中毒素出峰圖

圖6 本底樣品高效液相色譜檢測出峰圖

圖7 添加毒素樣品高效液相色譜檢測出峰圖（平行樣1）

2.5.2 微囊藻毒素粗毒素檢測

由于粗毒素中MC-RR，MC-LR含量較高，有7～8 mg/L，不在所得標準曲線的線性范圍之內(nèi)，故將其稀釋6倍，再進入高效液相色譜儀檢測.由于取出的1 mL粗毒素已被稀釋，同樣，這里計算出的毒素濃度最終也回歸到最初濃度，方便計算.檢測結果見表4、圖9.

2.5.3 加標回收率計算

實際樣品檢測加標回收率計算：

3 結 論

圖8 添加毒素樣品高效液相色譜檢測出峰圖（平行樣2）

圖9 粗毒素高效液相色譜檢測出峰圖

表4 粗毒素進樣檢測結果

采用添加微囊藻毒素粗提純品的方法，觀察不同樣品前處理方法和色譜條件下，對微囊藻毒素MC-RR，MC-LR的檢出能力以及排除雜質(zhì)的干擾，建立快速準確的對魚體樣品中微囊藻毒素的HPLC.結果表明，75%甲醇溶液的提取效果要優(yōu)于其他提取方法，提取效率最高.添加0.05%三氟乙酸的55%甲醇作為流動相，能得到特征峰最大出峰面積、特征峰與雜質(zhì)峰分離程度最顯著，出峰效果最好.MC-RR的回收率為84.1%，MC-LR的回收率為89.9%，MC-RR和MC-LR的平行進樣相對標準偏差分別為2%和5%，建立的SPE-HPLC分析微囊藻毒素的方法具有定量準確、靈敏度高、方法穩(wěn)定、回收率較高、操作簡單等特點，可以作為水產(chǎn)品中微囊藻毒素檢測的一種方法.

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