5-羥基癸酸鹽對大鼠低氧性肺動脈高壓的抑制作用

張麗萍，李 秋，舒 鷹，李云雷，陳成水

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江溫州 325000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺小動脈的血管痙攣、內(nèi)膜增生和重構及微血栓形成為主要特征的一種疾?。?］，患者最終常因右心衰竭而死亡。離體實驗研究表明，慢性低氧時大鼠肺動脈平滑肌細胞線粒體能夠感受血氧的下降，引起線粒體膜電位的去極化，并通過一系列途徑促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，而線粒體膜上ATP敏感鉀通道特異性抑制劑5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate，5-HD)能夠降低線粒體膜電位最終使肺動脈平滑肌細胞凋亡增多以及增殖減少［2－3］。炎癥機制在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，然而目前尚無5-HD能通過調(diào)節(jié)外周及肺組織中的某些炎癥因子及趨化因子而降低肺動脈壓的報道。本研究通過對低氧性PAH大鼠血清及肺組織炎癥指標及肺動脈壓力和血管結(jié)構的檢測，探討5-HD對大鼠PAH影響的機制和其對炎癥的作用，為PAH和肺源性心臟病新的防治方法的探索提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康清潔級雄性SD大鼠24只(由上海實驗動物購買中心提供)，體質(zhì)量200～250 g。清潔級環(huán)境飼養(yǎng)，室溫控制在22～25℃，濕度控制在40% ～70%，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑及儀器

5-HD(美國Sigma公司)，白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)，IL-8，巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1a及單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1 ELISA 試劑盒(武漢華美生物技術有限公司)，1%NP-40裂解液(江蘇碧云天生物科技公司)，IL-6，MCP-1山羊多克隆抗體(美國Santa公司)，超敏即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒PV-9003及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，酶標儀(美國Biotek公司)，MedLab生物數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，Image-pro plus6.0圖像采集系統(tǒng)(江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司)。

1.3 動物分組及模型制備

適應環(huán)境1周后，24只大鼠隨機分成正常對照組、低氧模型組及低氧+5-HD組。將低氧模型組和低氧+5-HD組在常壓低氧(9.5% ～10.5%)氧艙中進行低氧處理，采用間斷性常壓低氧模型，每天進行低氧處理8 h，每周6 d，艙內(nèi)水分用無水氯化鈣吸收，二氧化碳用鈉石灰吸收。1周后，低氧模型組每天sc給予PBS 5 mg·kg－1溶液，低氧+5-HD組大鼠每天先sc給予5-HD 5 mg·kg－1，再進入低氧艙，連續(xù)3周。

1.4 血流動力學指標及右心室肥厚指數(shù)的計算

大鼠ip給予5%水合氯醛400 mg·kg－1溶液行全身麻醉，然后將大鼠仰臥固定，分離右頸外靜脈，采用灌有肝素鈉溶液的聚乙烯導管，自右頸外靜脈插入，并將插管緩慢推入右心室進而插入肺動脈內(nèi)，用YL-4型壓力傳感器，將信號聯(lián)入MedLab生物數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)，測定平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)。采血后，開胸取出心臟，剪去左右心房、心耳、血管末端及其周圍的組織后，沿肺動脈出口處剪開右心室，其余為左心室和室間隔組織，然后分別稱重，按公式計算右心肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)，RVHI=右心室質(zhì)量/(左心室質(zhì)量+室間隔組織質(zhì)量)。

1.5 生物標本收集及處理

測壓完畢后，立即右心室取靜脈血3 ml，以700×g，4℃離心10 min后取上清液，－70℃冰箱保存，待測IL-6，IL-8，MIP-1a及MCP-1濃度。

處死大鼠，取右下肺組織，濾紙吸去表面的血跡和水分，用電子天平稱取肺組織約200 mg后放入－70℃冰箱中備用。所有的標本收集完畢后，取出肺組織復溫，剪碎，用1%NP-40裂解液裂解制備成肺組織勻漿，以6000×g，4℃離心5 min后，留取上清液待測IL-6，IL-8，MIP-1a及MCP-1濃度。

1.6 肺血管形態(tài)學分析

取左下肺組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(3 μm)。在蘇木素-伊紅(HE)染色切片上，光鏡下觀察肺組織與肺動脈形態(tài)學改變，選取斷面較圓的直徑20～150 μm的肺細小動脈，用圖像分析軟件測定肺動脈相對中膜厚度(pulmonary artery medial thickness，PAMT)。

1.7 血清及肺中 IL-6，IL-8，MIP-1a及 MCP-1濃度測定

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，操作步驟嚴格按照說明書進行，用酶標儀測定波長450 nm吸光度值(absorbance，A)。

1.8 免疫組化法測定肺動脈和支氣管中IL-6和MCP-1水平

免疫細胞化學染色采用超敏即用型二步法，按照PV-9003試劑盒說明書進行，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。每種一抗的稀釋度均為1∶100。正常對照組用PBS代替一抗。細胞質(zhì)染成棕黃色為陽性細胞。每一標本在肺動脈及細小支氣管各隨機選取5個視野，用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測定陽性產(chǎn)物的A值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 5-羥基癸酸鹽對低氧性肺動脈高壓大鼠血流動力學指標及右心肥厚指數(shù)的影響

與正常對照組相比，低氧模型組mPAP及RVHI顯著升高(P＜0.05);與低氧模型組相比，低氧+5-HD組壓及 RVHI顯著降低(P＜0.05)，基本恢復至正常對照組水平。表明5-HD能降低大鼠的PAH及 RVHI(表1)。

表15-羥基癸酸鹽(5-HD)對低氧性肺動脈高壓(PAH)大鼠肺動脈平均壓(mPAP)和右心肥厚指數(shù)(RVHI)的影響Tab.1 Effect of 5-hydroxydecanoate(5-HD)on mean pulmonary arterial pressure(mPAP)and right ventricular hypertrophy index(RVHI)in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension(PAH)rats

2.2 5-羥基癸酸鹽對低氧性PAH大鼠肺小血管組織形態(tài)的影響

光鏡下觀察HE染色肺組織切片顯示，正常組大鼠肺小動脈管壁較薄，管腔較大(圖1A);低氧模型組大鼠肺小動脈中膜平滑肌細胞顯著增生，管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，出現(xiàn)了肺血管重構現(xiàn)象(圖1B);而低氧+5-HD組大鼠肺小動脈中膜平滑肌細胞增殖受抑，管壁明顯變薄，管腔變大，肺血管重構程度較低氧模型組明顯減輕(圖1C)。肺小動脈圖像分析結(jié)果顯示，低氧模型組PAMT為0.311±0.030，較正常對照組0.169±0.033顯著升高(n=8，P ＜0.05)，與低氧模型組比較，5-HD組PAMT的0.197±0.027顯著降低(P ＜0.05)。

2.3 5-HD對低氧性大鼠血清及肺勻漿中 IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平的影響

如表2和表3所示，與正常對照組相比，低氧模型組大鼠血清IL-6，IL-8，MIP-1a，MCP-1水平均顯著升高(P＜0.05);與低氧模型組相比，而5-HD組大鼠血清IL-8，MIP-1a，MCP-1水平顯著降低(P＜0.05)，但IL-6水平與低氧模型組比較無明顯差異;在肺勻漿中各組大鼠的IL-6，IL-8，MIP-1a，MCP-1水平均無明顯差異。表明5-HD能降低PAH大鼠循環(huán)血中IL-8，MIP-1a和MCP-1水平。

2.4 5-HD對肺動脈和支氣管中IL-6和MCP-1的影響

低氧模型組肺動脈中IL-6和MCP-1表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，5-HD組肺動脈中IL-6，MCP-1表達水平與低氧模型組比較無明顯差異，但均有下降趨勢(圖2A，圖3A，表4)。本實驗結(jié)果還顯示，低氧模型組支氣管IL-6表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，而5-HD組支氣管IL-6表達水平與低氧模型組比較無明顯差異;各組支氣管MCP-1表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(圖2B，圖3B，表4和表5)。

圖1 5-HD對低氧性PAH大鼠肺動脈形態(tài)的影響 (HE，×200).A:正常對照;B:低氧模型;C:低氧+5-HD.Fig.1 Effect of 5-HD on pulmonary artery histopathology in hypoxia-induced PAH rats(HE，×200).

表25-HD對低氧性PAH大鼠血清中白細胞介素IL-6，IL-8，巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-1a和單核細胞趨化蛋白(MCP)-1水平的影響Tab.2 Effect of 5-HD on interleukin 6(IL-6)，IL-8，macrophage inflammatory protein(MIP)-1a and monocyte chemoattractant protein(MCP)-1 in the serum of hypoxia-induced PAH rats

表35-HD對低氧性PAH大鼠肺中IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平的影響Tab.3 Effect of 5-HD on IL-6，IL-8，MIP-1a and MCP-1 in the lungs of hypoxia-induced PAH rats

圖25-HD對低氧性PAH大鼠肺動脈(A)及支氣管(B)中IL-6水平的影響 (DAB ×400).棕黃色陽性表達細胞.1:正常對照組;2:低氧模型組;3:低氧+5-HD組.Fig.2 Effect of 5-HD on the IL-6 level of pulmonary artery(A)and bronchia(B)in hypoxia-induced PAH rats by immunohistochemistry(DAB ×400).

圖35-HD對低氧性PAH大鼠肺動脈(A)及支氣管(B)中MCP-1表達的影響.(DAB ×400).棕黃色陽性表達細胞.1:正常對照組;2:低氧組;3:低氧+5-HD組.Fig.3 Effect of 5-HD on the MCP-1 level of pulmonary artery(A)and bronchia(B)in hypoxia-induced PAH rats by immunohistochemistry(DAB ×400).

表45-HD對低氧性PAH大鼠肺動脈中IL-6和MCP-1水平的影響Tab.4 Effect of 5-HD on IL-6 and MCP-1 in pulmonary artery of hypoxia-induced PAH rats

動物分組處理見表1.采用超敏即用二步法測定肺動脈中炎癥因子

表55-HD對低氧性PAH大鼠支氣管中IL-6和MCP-1水平的影響Tab.5 Effect of 5-HD on IL-6 and MCP-1 levels in bronchia of hypoxia-induced PAH rats

3 討論

肺血管重構是低氧引起的PAH中晚期的主要表現(xiàn)，是由于血管壁細胞增殖和凋亡失衡所致［4］。內(nèi)皮功能的失調(diào)是PAH的特征性表現(xiàn)，內(nèi)皮功能失調(diào)導致血管舒張因子和收縮因子平衡失調(diào)，影響肺動脈平滑肌細胞，使血栓形成及炎癥細胞因子產(chǎn)生［5］，導致肺動脈平滑肌細胞發(fā)生增殖，使管壁增厚，管腔狹窄。本實驗成功復制了低氧性PAH的模型，表現(xiàn)為mPAP增高，肺小動脈管壁增厚，管腔變小，右心室肥厚。

已有大量證據(jù)支持炎癥機制參與PAH的病理生理過程［6－7］。PAH患者的循環(huán)血IL-1和IL-6等炎癥細胞因子及MIP-1a，MCP-1，T細胞激活分泌調(diào)節(jié)因子和表皮可溶性趨化因子等趨化因子的水平升高，周圍血管有淋巴細胞和吞噬細胞等炎癥細胞的浸潤［8－10］。IL-6是一種由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和成纖維細胞等產(chǎn)生和分泌的多功能的炎癥前細胞因子，在PAH形成過程中有調(diào)節(jié)肺血管炎癥及重塑的作用。IL-8是重要的趨化和激活多形核中性粒細胞的細胞因子，能夠激活中性粒細胞和趨化吸引中性粒細胞到炎癥部位，觸發(fā)脫顆粒和表面黏附分子的表達及活性氧分子產(chǎn)物的釋放，是中性粒細胞激活和遷移的重要調(diào)節(jié)因子。MIP-1a和MCP-1均屬于趨化因子家族中成員，由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等炎癥細胞分泌，能夠促使單核細胞由外周循環(huán)遷移至炎癥部位聚集并激活，加重局部炎癥反應。MIP-1a一方面可通過調(diào)節(jié)炎癥過程促使PAH的形成，另一方面通過促進血管生成而促使PAH基礎病理形成［11］。本研究結(jié)果顯示，低氧模型組血清中IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平均明顯高于正常對照組，提示低氧可加重肺循環(huán)炎癥反應，引起循環(huán)血中炎癥因子及趨化因子表達增加，這與國外的多項研究結(jié)果相符［6，12－13］。

研究顯示，在機體低氧的情況下，mitoKATP通道開放，K+內(nèi)流，線粒體膜去極化，從而影響細胞氧自由基、細胞色素C等的生成和分配及多種蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制細胞凋亡［14－15］。前期在體實驗已經(jīng)證實，5-HD能降低低氧引起的大鼠PAH及肺血管重構［16］。但對于5-HD是如何降低在體大鼠PAH的機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，應用5-HD能顯著降低低氧引起的大鼠肺動脈平均壓及RVHI，并顯著降低血清中IL-8，MIP-1a和MCP-1水平。5-HD可能通過抑制某些趨化因子的分泌，減輕低氧引起的PAH大鼠的炎癥反應。肺組織勻漿中IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平在各組中的表達未見明顯差別，提示PAH大鼠總體炎癥因子的水平主要取決于循環(huán)血而并非由肺部決定。

免疫組化研究結(jié)果顯示，低氧能誘導肺動脈IL-6和MCP-1表達增加，這與以往實驗結(jié)果符合［17］，5-HD干預后其表達有所下降。低氧還能誘導大鼠支氣管中IL-6表達增加，而5-HD并不能減少其在支氣管的表達;并發(fā)現(xiàn)MCP-1對支氣管無顯著影響。

綜上所述，目前研究表明，mitoKATP的抑制劑5-HD對在體大鼠PAH具有一定的抗炎作用。5-HD可能具有有效降低低氧性PAH大鼠循環(huán)血中IL-8，MIP-1a和MCP-1水平，延緩PAH的發(fā)生，降低PAH的嚴重程度。但由于目前5-HD在PAH中的研究仍屬較少，其具體機制及對其他器官的作用有待進一步研究和證實。

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