腦內(nèi)注射納米三氧化二鐵對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響及對腹側(cè)中腦的損傷作用

劉袁靜，李 濤，曾水林，王健華，史婷婷，朱建寶

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，江蘇南京 210009)

近年來研究證實，納米顆粒可以通過呼吸道吸入、胃腸道吸收、皮膚組織的滲透、注射等途徑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入各組織而產(chǎn)生影響［1］。由于納米顆粒的特殊性質(zhì)，直徑較小的顆粒可通過血腦屏障，顆粒尺寸越小進(jìn)入腦的量越多，越容易進(jìn)入較深的腦區(qū)，產(chǎn)生的損傷越嚴(yán)重［2］。動物實驗顯示，納米顆粒對心、肺、肝和脾等器官有不同程度的毒性損害作用［3］。納米三氧化二鐵(ferric oxide nanoparticles，nano-Fe2O3)擬作為影像學(xué)診斷標(biāo)記物和藥物治療載體用于臨床，藥物釋放后剩余的nano-Fe2O3顆粒載體不能被很快地代謝，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的積累對神經(jīng)系統(tǒng)，尤其對腦有毒性作用值得研究。Ben-Shachar等［4］、陳先文等［5］及姜宏等［6］分別將FeCl3直接注射入大鼠黑質(zhì)內(nèi)，觀察到高濃度FeCl3對黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元有損傷作用，并導(dǎo)致類似帕金森病(Parkinson's disease，PD)樣自主運動功能障礙。據(jù)報道［4，7］，部分PD患者和PD動物模型有學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙。本實驗將nano-Fe2O3注入大鼠腹側(cè)中腦，觀察nano-Fe2O3對動物學(xué)習(xí)記憶功能的影響和腹側(cè)中腦組織的形態(tài)學(xué)變化，為nano-Fe2O3應(yīng)用于臨床的安全性評價，提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

nano-Fe2O3由東南大學(xué)納米技術(shù)研究中心實驗室制備，直徑10 nm，濃度20 g·L－1;小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體(美國Sigma公司);兔抗大鼠膠質(zhì)纖絲酸性蛋白質(zhì)(GFAP)多克隆抗體(美國Sigma公司);小鼠抗大鼠OX-42單克隆抗體(英國AbD Serotec公司);通用型過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(SP-9000)免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，濃縮DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

江灣Ⅱ型立體定位儀(第二軍醫(yī)大學(xué))，大鼠Morris水迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司Morris水迷宮及視頻系統(tǒng)RD1101-MM)，CM-1900冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)和Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，Leica圖像處理系統(tǒng)(德國Leica公司)。

1.2 動物及分組處理

健康成年SD大鼠42只，♂，體質(zhì)量200～250 g，由東南大學(xué)實驗動物中心提供〔實驗動物使用許可證號:SYSK(蘇)2010-0004〕。按照Morris水迷宮實驗要求，篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的36只，隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為正常對照組，溶劑(生理鹽水)組，nano-Fe2O3后1，2，3和4周取樣組。除正常對照組大鼠外，其余大鼠ip 給予0.4%戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)麻醉后，固定于立體定位儀上，常規(guī)消毒，開顱，暴露前囟，參照Paxinos-Watson大鼠圖譜，注射靶點為中腦黒質(zhì)(substantia nigra，SN)和腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)，SN 注射點坐標(biāo)(mm)為AP:－4.8;ML:1.8;DV:9.2;VTA 注射點坐標(biāo)(mm)為 AP:－4.8;ML:1.0;DV:9.2。nano-Fe2O3組與溶劑對照組在腦立體定位下各一次性注射1 μl nano-Fe2O320 g·L－1或生理鹽水，注射速度 0.2 μl·min－1。注射完畢，留針 10 min，提針 0.5 mm 后，再留針1 min，然后按 2.0 mm·min－1速度緩慢拔針。術(shù)后大鼠包被保暖，清醒后置籠喂養(yǎng)。分別于藥后1，2，3和4周行Morris水迷宮實驗，灌流取腦行Perls反應(yīng)和免疫組織化學(xué)染色。

1.3 Morris水迷宮實驗測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

Morris水迷宮直徑160 cm、水深30 cm、站臺直徑11 cm、高28 cm。將Morris水迷宮以水池邊緣相等分布的4個點作為入水點，將圓形水池等分為4個象限，平臺位于第四象限內(nèi)，在水面下2 cm。水中加入墨汁以使水不透明，保持水溫在(25±1)℃，水迷宮外視覺線索相對固定。

隨機(jī)選擇入水點(即第一象限)，按逆時針方向，將大鼠從各象限邊緣中點位置面向池壁放入水中，允許大鼠用300 s找到隱藏在水下的逃避平臺，找到平臺后允許在平臺上停留10 s，如果在規(guī)定時間內(nèi)找不到平臺，實驗者幫助其找到平臺并允許在平臺上停留10 s，之后再進(jìn)行下一次訓(xùn)練，每天連續(xù)訓(xùn)練4次，將4次的算術(shù)平均值記為當(dāng)天的成績，持續(xù)訓(xùn)練4 d。

在制作動物模型前測試，測試時任選一個入水點(即第二象限)將大鼠面向池壁放入水中，記錄180 s內(nèi)在目標(biāo)象限(即第四象限)運動時間。藥后1，2，3和4周用相同的方法進(jìn)行Morris水迷宮檢測。實時監(jiān)控，并記錄找到平臺時間、游泳距離、游泳速度、潛伏期和搜索平臺策略。

1.4 Perls反應(yīng)法與免疫組織化學(xué)染色檢測nano-Fe2O3對大鼠腹側(cè)大腦的損傷

各組實驗動物在行Morris水迷宮測試后，ip給予0.4%戊巴比妥鈉，于深度麻醉下心臟灌注肝素化生理鹽水250 ml，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛400 ml。取全腦置于4%多聚甲醛溶液后固定24 h，入30%蔗糖溶液至沉底。取中腦行冰凍連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm。分 3 份分別行 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+、OX-42+/鐵+免疫組化染色［8］。

1.4.1 Perls反應(yīng)法(普魯士藍(lán)反應(yīng))

在Perls液(20%亞鐵氰化鉀水溶液25 ml，2%鹽酸水溶液25 ml。兩液分別配制貯存，臨用前等量混合，過濾后使用)中反應(yīng)20～30 min，蒸餾水充分漂洗終止反應(yīng)。

1.4.2 免疫組化(SP法)

Perls反應(yīng)后的切片用 PBS 0.01 mol·L－1(pH 7.4)沖洗5 min，加3%H2O2去離子水反應(yīng)15 min，PBS洗5 min×3次，加10%山羊血清37℃反應(yīng)30 min封閉(不洗)，再加小鼠抗大鼠 TH抗體(1∶10 000)或兔抗大鼠 GFAP 抗體(1∶80)4℃ 過夜，或小鼠抗大鼠OX-42抗體(1∶200)4℃ 48 h。用PBS洗5 min×3次，加生物素化二抗 (1∶100)37℃60 min，PBS洗5 min×3次，加入過氧化物酶復(fù)合物(1∶100)37℃ 30 min，PBS洗5 min×3 次，后用DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，在PBS中貼片，干燥后脫水、透明、封片。另外任取一張切片作陰性對照，用正常羊血清代替一抗，結(jié)果為陰性。每個獨立組收集數(shù)據(jù)的樣本數(shù)為4，每個樣本取腹側(cè)中腦黒質(zhì)區(qū)相同序列切片6張，在200倍光鏡下隨機(jī)計數(shù)10個非重疊視野分別計數(shù) TH+/鐵+、GFAP+/鐵+、OX-42+/鐵+細(xì)胞數(shù)，TH+、GFAP+和 OX-42+單標(biāo)細(xì)胞數(shù)，采用DP Controller進(jìn)行圖像分析，計數(shù)陽性細(xì)胞，并照相。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，各組間結(jié)果比較采用配對t檢驗進(jìn)行方差分析;搜索平臺策略采用構(gòu)成比進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 腦內(nèi)注射納米三氧化二鐵對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對照組比較，溶劑對照組各項指標(biāo)沒有明顯差異，說明生理鹽水對大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能無影響。nano-Fe2O3后1～4周游泳速度明顯變慢(P＜0.05);藥后2和3周找到平臺時間和潛伏期明顯變長(P＜0.05);nano-Fe2O3藥后游泳距離隨時間的增加呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 腦內(nèi)注射納米三氧化二鐵對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響Tab.1 Effect of intracerebral injection of nano-Fe2O3on the spatial learning and memory in rats

搜尋平臺策略結(jié)果顯示，正常對照組以趨向式為主(4/6)，生理鹽水組以趨向式(3/6)和隨機(jī)式軌跡為主(3/6)，藥后1周以隨機(jī)式(3/6)和邊緣式(2/6)，藥后2周以隨機(jī)式(2/6)和邊緣式(4/6)為主，藥后3周以隨機(jī)式(3/6)和邊緣式(3/6)為主，藥后4周以隨機(jī)式為主(5/6)。

2.2 腦內(nèi)注射納米三氧化二鐵對大鼠腹側(cè)中腦的損傷作用

Perls反應(yīng)與免疫組化染色結(jié)果顯示，注射生理鹽水大鼠腦黑質(zhì)可見大量TH+細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)飽滿清晰，胞漿內(nèi)未見有nano-Fe2O3顆粒，TH+纖維密集，交織成網(wǎng)(圖1A);而nano-Fe2O3組TH+細(xì)胞明顯減少，在殘存的TH+細(xì)胞胞漿內(nèi)可見nano-Fe2O3顆粒沉積，即TH+/鐵+雙標(biāo)細(xì)胞(圖1B中箭頭指示)，TH+纖維稀少，排列紊亂(圖1D);正常對照組僅見GFAP+，OX-42+單標(biāo)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，數(shù)量較少，OX-42+單標(biāo)細(xì)胞呈散在分布(圖1C，E)，nano-Fe2O3組可見大量 GFAP+/鐵+和 OX-42+/鐵+雙標(biāo)細(xì)胞(圖1D，F(xiàn)中箭頭指示)，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿內(nèi)有吞噬的nano-Fe2O3顆粒，突起粗而短，整個細(xì)胞呈反應(yīng)性增大，細(xì)胞數(shù)量明顯增加。

圖1 Perls反應(yīng)法與免疫組化 DAB顯色檢測腦內(nèi)注射納米三氧化二鐵對大鼠腹側(cè)中腦的損傷作用 (×400).A，C和E分別為正常對照組的 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+和 OX-42+/鐵+染色結(jié)果;B，D和F分別為 nano-Fe2O3組的 TH+/鐵+、GFAP+/鐵+和OX-42+/鐵+染色.Fig.1 Effect of intracerebral injection of nano-Fe2O3on ventral midbrain injury by Perls reaction and immunohistochemical reaction(×400).

表2 大鼠腹側(cè)中腦注射納米三氧化二鐵對TH+、GFAP+和OX-42+陽性細(xì)胞數(shù)的影響Tab.2 Effect of ventral midbrain injection of nano-Fe2O3 on positive cell numbers of TH+，GFAP+and OX-42+in rats

注射nano-Fe2O3藥后1～4周，大鼠中腦黑質(zhì)TH+/鐵+、GFAP+/鐵+、OX-42+/鐵+雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)量沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(數(shù)據(jù)未提供)。表2結(jié)果顯示，與正常對照組相比，注射生理鹽水對TH+、GFAP+和OX-42+單標(biāo)細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異，注射nano-Fe2O3藥后1～4周TH+細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P＜0.05)，GFAP+和OX-42+單標(biāo)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P ＜0.01)。

3 討論

Morris水迷宮研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):nano-Fe2O3組藥后2和3周找到平臺時間和潛伏期變長;搜索平臺策略，正常對照和生理鹽水組以趨向式和隨機(jī)式為主，nano-Fe2O3組用藥后以隨機(jī)式和邊緣式為主，說明nano-Fe2O3損傷中腦腹側(cè)DA能神經(jīng)元，影響到與認(rèn)知功能密切相關(guān)的海馬、大腦皮質(zhì)額葉及其環(huán)路，引起認(rèn)知功能障礙。已有證據(jù)顯示［7，9］，額前皮質(zhì)在學(xué)習(xí)記憶中起關(guān)鍵作用，而大多數(shù)到達(dá)前額葉皮質(zhì)的DA能傳出神經(jīng)發(fā)自VTA，部分發(fā)自SN，前額葉皮質(zhì)通過發(fā)自于SN的DA能投射調(diào)節(jié)皮質(zhì)-基底節(jié)環(huán)路處理記憶信息。本實驗藥后1周和4周與正常對照組無顯著差異可能與藥物濃度及時間和小膠質(zhì)細(xì)胞對納米鐵的清除及星形膠質(zhì)細(xì)胞對局部損傷的修復(fù)有關(guān)［10－11］。nano-Fe2O3組藥后各組游泳速度均慢于正常對照組，可能與nano-Fe2O3對SN和VTA區(qū)DA能神經(jīng)元的損傷作用有關(guān)，與臨床上PD患者出現(xiàn)運動遲緩、肌肉僵直和震顫等癥狀有一定的相似性。

本實驗結(jié)果顯示，腦內(nèi)注射nano-Fe2O3破壞黒質(zhì)DA能神經(jīng)元，刺激膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加，膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬nano-Fe2O3顆粒而限制其在組織中蓄積。據(jù)報道［11］，在損傷前期，膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬異物、分泌營養(yǎng)因子、通過自身的抗氧化應(yīng)激作用、對神經(jīng)毒物的清除等而發(fā)揮保護(hù)作用;在損傷后期，激活的膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生炎癥和神經(jīng)毒性因子，以不同途徑啟動細(xì)胞內(nèi)某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的損傷。姜宏等［6］實驗結(jié)果已證實，黑質(zhì)內(nèi)的鐵和尾狀核DA含量之間有直接關(guān)系，即鐵增加后，尾狀核的DA含量顯著減少。nano-Fe2O3組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH+細(xì)胞內(nèi)有鐵顆粒沉積及對DA能神經(jīng)元的損傷作用，與陳先文等［5］的報道是一致的。本實驗研究結(jié)果表明，膠質(zhì)細(xì)胞在nano-Fe2O3注射后數(shù)量就大量增加，TH+細(xì)胞數(shù)量在藥后1周減少不顯著與膠質(zhì)細(xì)胞在損傷前期的保護(hù)作用有一定的相關(guān)性，在藥后2和3周減少非常顯著與損傷后期產(chǎn)生的炎癥和神經(jīng)毒性因子促使DA能神經(jīng)元損傷有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD中起雙重作用［12］，一方面星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過分泌神經(jīng)元所需的神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子以及合成單胺類氧化酶等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;另一方面在刺激因子作用下活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過釋放炎癥因子、氧自由基、影響谷氨酸和自由鐵的代謝等促進(jìn)PD的發(fā)生發(fā)展。因此，膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠DA能神經(jīng)元損傷方面起著雙重作用。

本實驗結(jié)果顯示，腦內(nèi)注射nano-Fe2O3后損傷了SN和VTA，可導(dǎo)致動物的空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙，引起DA能神經(jīng)元的破壞及膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的改變。Kircher等［13］用(280 ± 80)nm的Fe2O3通過鼻吸的方法證實，海馬的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，說明吸入小顆粒的nano-Fe2O3可以對CNS產(chǎn)生毒性作用。汪冰等［14］用(280 ±80)nm和21 nm的Fe2O3通過鼻腔滴注的方法證實納米顆?？梢詽B透到大腦的深部，并且觀察到有破壞海馬細(xì)胞形態(tài)的潛能，也可進(jìn)入腦干和中腦等較深腦區(qū)。nano-Fe2O3擬作為藥物診療常用載體或經(jīng)常在nano-Fe2O3顆粒環(huán)境中工作，其對神經(jīng)系統(tǒng)的影響不容忽視，長期大劑量接觸或使用nano-Fe2O3應(yīng)考慮安全性。關(guān)于不同粒徑的nano-Fe2O3顆粒經(jīng)不同途徑進(jìn)入人體對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用尤其是對中腦的損傷作用及其機(jī)制尚需做進(jìn)一步的研究。

［1］ Hu YL，Gao JQ.Potential neurotoxicity of nanoparticles［J］.Int J Pharm，2010，394(1-2):115-121.

［2］ 常雪靈，祖 艷，趙宇亮.納米毒理學(xué)與安全性中的納米對與納米結(jié)構(gòu)效應(yīng)［J］.科學(xué)通報，2011，56(2):108-118.

［3］ Braydich-Stolle L， Hussain S， Schlager JJ，Hofmann MC.In vitro cytotoxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells［J］.Toxicol Sci，2005，88(2):412-419.

［4］ Ben-Shachar D， Youdim MB. Intranigraliron injection induces behavioral and biochemical"parkinsonism"in rats［J］.J Neurochem，1991，57(6):2133-2135.

［5］ 陳先文，陳生弟，劉振國，肖 勤，王 瑛，翁中芳.鐵劑誘發(fā)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2002，21(1):44-47.

［6］ 姜 宏，謝俊霞.腦內(nèi)高鐵在帕金森病病因中的作用［J］.中國神經(jīng)科學(xué)雜志，2001，17(2):201-204.

［7］ Grahn JA，Parkinson JA，Owen AM.The role of the basal ganglia in learning and memory:neuropsychological studies［J］.Behav Brain Res，2009，199(1):53-60.

［8］ Yang J，Liu J，Niu G，Chan KC，Wang R，Liu Y，et al.In vivo MRI of endogenous stem/progenitor cell migration from subventricular zone in normal and injured developing brains［J］.Neuroimage，2009，48(2):319-328.

［9］ Faw B.Pre-frontal executive committee for perception，working memory，attention，long-term memory，motor control，and thinking:a tutorial review［J］.Conscious Cogn，2003，12(1):83-139.

［10］ Whitton PS. Inflammation as a causative factor in the aetiology of Parkinson's disease［J］.Br J Pharmacol，2007，150(8):963-976.

［11］ 白龍梅，李學(xué)忠.劉春風(fēng).星形膠質(zhì)細(xì)胞在帕金森病中的作用研究現(xiàn)狀［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2007，34(5):463-467.

［12］ 東春陽，何德富，翁恩琪.鐵元素與帕金森?。跩］.環(huán)境與健康雜志，2008，25(1):88-90.

［13］ Kircher MF， Mahmood U， King RS， Weissleder R，Josephson L.A multimodal nanoparticle for preoperative magnetic resonance imaging and intraoperative optical brain tumor delineation［J］.Cancer Res，2003，63(23):8122-8125.

［14］ Wang B，F(xiàn)eng WY，Wang M，Shi JW，Zhang F，Ouyang H，et al.Transport of intranasally instilled fine Fe2O3particles into the brain:micro-distribution，chemical states，and histopathological observation［J］.Biol Trace Elem Res，2007，118(3):233-243.