選擇性血漿分離器行雙重血漿置換對抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體清除的研究

龔德華 季大璽 朱冬冬 徐 斌 崔 俊 劉志紅

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)相關(guān)血管炎(AAV)是一組血清ANCA陽性，臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)小血管炎性損害的疾病。AAV常累及肺部及腎臟，腎臟損害多表現(xiàn)為急進(jìn)性腎炎。在疾病的急性發(fā)作期，特別是危及患者生命的臨床癥狀出現(xiàn)時，治療的關(guān)鍵是快速誘導(dǎo)疾病的緩解，減輕及逆轉(zhuǎn)臟器損害，方法包括大劑量甲潑尼龍聯(lián)合免疫抑制劑治療。盡管目前診斷技術(shù)及治療方法不斷改進(jìn)，仍有相當(dāng)部分患者由于嚴(yán)重并發(fā)癥導(dǎo)致死亡，或出現(xiàn)終末期腎病(ESRD)，嚴(yán)重影響患者長期預(yù)后。國外資料顯示5年內(nèi)20%患者出現(xiàn)ESRD［1］，而國內(nèi)資料則顯示1年和3年腎存活率分別為66.8%和58.5%［2，3］。就診時即有明顯腎功能損害者預(yù)后更差，且對藥物治療反應(yīng)不佳。目前發(fā)現(xiàn)的ANCA主要有兩種類型，即針對中性粒細(xì)胞胞質(zhì)嗜中性顆粒及單核細(xì)胞溶酶體髓過氧化物酶(MPO－ANCA)及針對蛋白酶 3(PR3－ANCA)的抗體?，F(xiàn)認(rèn)為ANCA在疾病的發(fā)病中起重要作用，且抗體滴度與疾病的活動度密切相關(guān)［4］。因此臨床實踐中也采用體外循環(huán)血液凈化方法從循環(huán)中迅速清除致病性抗體，以期誘導(dǎo)疾病的緩解。血漿置換(PE)是一種常用的清除自身抗體的方法。其優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，缺點(diǎn)是其清除非選擇性，丟失大量有用血漿蛋白，需補(bǔ)充大量人體白蛋白或血漿［5］。在此基礎(chǔ)上的改進(jìn)方法為雙重血漿置換(DFPP)，即先采用血漿分離器(一級濾器，膜孔0.2～0.5 μm)將血漿分離出來，血漿再經(jīng)過血漿成分分離器(二級濾器，膜孔0.01～0.02 μm)濾過，分子量較小的血漿成分(主要為白蛋白及小分子蛋白)被二級濾器濾出后回輸體內(nèi)，而分子量較大的血漿成分(主要為免疫球蛋白，包含自身抗體)被截留而丟棄。DFPP由于相對選擇性清除血漿大分子蛋白，減少了白蛋白的丟失及補(bǔ)充量，可增加單次治療處理血漿量，有助提高致病性抗體的清除率［6］。雖然DFPP較PE清除蛋白的選擇性增加，但同樣存在大量有用蛋白丟失的問題，如非致病性免疫球蛋白及大分子凝血因子的丟失［7］。目前少有研究報道如何進(jìn)一步提高DFPP清除蛋白的選擇性，減少有用蛋白的丟失。本文提出一種新的DFPP方法，用于治療AAV患者，即選擇性血漿分離器行DFPP，觀察對免疫球蛋白及ANCA的清除情況，并與原有DFPP方法，即采用普通血漿分離器與血漿成分分離器聯(lián)合進(jìn)行了對比，現(xiàn)報告如下。

對象和方法

研究對象 2010年4月至2011年4月南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所共對15例確診為MPO－ANCA相關(guān)血管炎伴腎功能不全患者行DFPP治療44次?；颊吣行?例，女性6例，平均年齡(53.9±15.6)歲(43～72歲)，臨床均表現(xiàn)為急進(jìn)性腎炎，治療前平均血清肌酐(SCr)(433.16±88.4)μmol/L，腎外并發(fā)癥3例(突發(fā)性耳聾1例，咯血2例)。藥物治療方案如下:甲潑尼龍0.5g，靜脈滴注，連續(xù)3d，后予口服潑尼松30～45 mg/d維持，同時口服霉酚酸酯0.5 g/d，1例患者雷公藤多苷60 mg/d?；颊咴诩诐娔猃堉委熃Y(jié)束后開始DFPP治療。所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

DFPP方法 均采用右側(cè)頸內(nèi)靜脈留置雙腔導(dǎo)管作血管通路，DFPP采用血液凈化裝置 IQ21(Asahi Kasei Kuraray Medical CO，Ltd，日本)進(jìn)行，體外循環(huán)聯(lián)接示意圖見圖1，采用低分子肝素聯(lián)合枸櫞酸抗凝，使活化凝血時間延長一倍以上。血流量設(shè)置為120～150 ml/min，一級濾器血漿分離流量為30～40 ml/min，二級濾器再循環(huán)流量為 60 ml/min。治療步驟如下:(1)治療開始時，一級濾器濾出血漿進(jìn)入二級濾器再次濾過，濾出的血漿再經(jīng)一微濾器后回輸體內(nèi)(微濾器起超濾脫水的作用)，被截留的血漿成分滯留在二級濾器中不斷再循環(huán)，此時二級濾器后通往棄漿袋的三通呈關(guān)閉狀態(tài);(2)當(dāng)二級濾器前壓力逐步升高，超過150～160 mmHg時，將一級濾器后三通轉(zhuǎn)向生理鹽水通路，停止分離血漿，采用生理鹽水800 ml沖二級濾器，使二級濾器中滯留血漿成分進(jìn)一步濾過回輸體內(nèi);(3)生理鹽水沖濾器完畢后，將二級濾器后的三通轉(zhuǎn)向棄漿袋，使二級濾器中仍殘留的血漿成分進(jìn)入棄漿袋丟棄。這一過程即為一個循環(huán)，結(jié)束后即將一級濾器后的三通轉(zhuǎn)向血漿分離通路，繼續(xù)分離血漿及處理血漿，開始下一治療循環(huán)。處理血漿達(dá)2倍血漿容量時即結(jié)束治療。整個過程中共補(bǔ)充人體白蛋白30～40g。意大利，面積0.68m2，最大孔徑0.5 μm)作一級濾器，采用 EC50W(Asahi Kasei Medical CO，Ltd，日本，面積2.0m2，孔徑0.03 μm)作二級濾器。有1例患者采用此種方法行DFPP 3次，因清除免疫球蛋白G(IgG)不理想，后續(xù)患者未再采用此方法。

圖1 雙重血漿濾過體外循環(huán)聯(lián)接示意圖

MPS07/EC20W組 采用MPS07作一級濾器，采用 EC20W(Asahi Kasei Medical CO，Ltd，日本，面積2.0m2，孔徑0.01 μm)作二級濾器，有9例患者采用此種方法行DFPP 27次。

EC50W/EC20W組 采用EC50W作一級濾器，采用EC20W作二級濾器。最后5例患者采用此種方法行DFPP 14次。

標(biāo)本采集 患者在每次治療前后采血;每次治療第一循環(huán)第一步驟結(jié)束時，同時從第1、第2、第3及第4采血點(diǎn)取標(biāo)本;第二步驟結(jié)束時，同時從第3及第4采血點(diǎn)取標(biāo)本;每次治療結(jié)束時稱取廢棄血漿重量及留取廢液標(biāo)本。留取的標(biāo)本檢測血漿總蛋白、球蛋白、白蛋白及 IgA、IgG、IgM 水平及 MPOANCA滴度。MPO－ANCA采用ELISA方法檢測，所用MPO購自SCIMEDX公司(美國)。

計算公式

濾器選擇 本研究為非隨機(jī)、前瞻性觀察性研究，擬對比三種方法對免疫球蛋白及自身抗體的清除情況。根據(jù)患者所使用濾器，分為三組:

MPS07/EC50W組 采用MPS07(Bellco s.p.a，

單次治療下降百分率(R)=(1－治療后濃度/治療前濃度)×100%

一級濾器篩選系數(shù)(SC)=采血點(diǎn)2濃度/采血點(diǎn)1濃度

二級濾器篩選系數(shù)(SC)=采用點(diǎn)3濃度/采血點(diǎn)4濃度

清除指數(shù)=(廢液濃度×廢液量)/(治療前血液濃度×血漿容量)

白蛋白清除指數(shù)=(廢液白蛋白濃度×廢液量)/(治療前血清白蛋白濃度×血漿容量+補(bǔ)充白蛋白量)

統(tǒng)計學(xué)方法 分析采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。治療前后濃度比較采用成對樣本均數(shù)比較的student－t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

15 例患者共接受44次DFPP治療，治療過程順利，無一例患者出現(xiàn)治療相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。治療結(jié)束后，2例咯血患者癥狀緩解，15例患者腎功能穩(wěn)定，無需腎臟替代治療，1例治療前已開始腎臟替代治療患者，腎功能未恢復(fù)，改為維持性透析治療。所有患者血ANCA滴度顯著下降。

三種濾器的篩選系數(shù) MPS07為一級血漿分離器，能濾過絕大部分血漿白蛋白、IgA、IgG及IgM;EC50W為二級血漿成分分離器，但膜孔徑相對較大，能濾過大部分白蛋白，部分 IgA、IgG及少量IgM;EC20W為膜孔徑較小的二級血漿成分分離器，只能濾過部分白蛋白及IgG，少量IgA，及極少量IgM(圖2)。

圖2 血漿蛋白篩選系數(shù)

單次治療血漿蛋白下降百分率 三種方法對白蛋白的清除相當(dāng)，每次治療補(bǔ)充30～40g人體白蛋白情況下，對血漿白蛋白影響不明顯。MPS07/EC50W組合對IgM清除最突出，其次為IgA，而對IgG清除則相對較少;MPS07/EC20W組合對三種免疫球蛋白清除都很明顯;EC50W/EC20W組合對IgA及IgG清除較明顯，而對IgM則基本不清除(圖3)。

圖3 單次治療血漿蛋白下降百分率

MPS07/EC20W與EC50W/EC20W組合對ANCA的清除 MPS07/EC20W及EC50W/EC20W兩種組合單次治療IgG下降率分別為(51.0±10.0)%及(43.5±13.8)%，而MPO－ANCA水平下降率分別為(31.1±14.0)%及(34.6±14.3)%(表1)。

EC50W/EC20W組合DFPP每一循環(huán)中生理鹽水沖二級濾器前后對濾器中蛋白濃度的影響 當(dāng)每一循環(huán)中二級濾器前壓力達(dá)到150～160 mmHg時，測定二級濾器血漿白蛋白及IgG濃度顯著升高，在采用生理鹽水沖濾器后兩者都顯著下降，而白蛋白更明顯(表2)。濾器中IgG/白蛋白濃度比在沖濾器后升高24.2%。

表1 采用不同血漿分離器行雙重血漿置換對血漿蛋白的清除

表2 生理鹽水沖洗前后二級濾器中蛋白濃度變化(n=5)

討 論

采用體外循環(huán)血液凈化方法清除體內(nèi)致病性物質(zhì)已在臨床廣泛用于治療自身免疫性疾病，如重癥肌無力，ANCA相關(guān)血管炎，抗GBM抗體介導(dǎo)肺腎綜合征等。血液凈化方法包括PE和免疫吸附等［8－10］。其中PE由于方法簡單使用相對普遍。與PE相比，DFPP相對選擇性清除血漿中分子量較大的致病物質(zhì)，而分子量較小的白蛋白則被回收體內(nèi)，減少有用物質(zhì)的丟失及所需外源性蛋白的補(bǔ)充量，在臨床使用也逐漸增多。

應(yīng)用DFPP時，首先需選擇濾器，通常是選擇血漿分離器作一級濾器，將血液中所有血漿成分濾出，再選擇血漿成分分離器作二級濾器，對一級濾過的血漿再次濾過，回收小分子蛋白(主要是白蛋白)，而不能濾過物質(zhì)(主要是免疫球蛋白)則被丟棄。血漿成分分離器根據(jù)其膜孔徑不同分為不同型號，本文測定了EC50W及EC20W兩種濾器對不同蛋白的清除特性。結(jié)合這一特性，臨床可根據(jù)欲清除致病物質(zhì)的分子量大小選擇不同二級濾器。選擇MPS07/EC50W組合，最突出的是對IgM的清除，單次治療下降率可達(dá)90%，而對IgG則影響較小，因此可用于一些分子量特別大的致病物質(zhì)的清除，如華氏巨球蛋白血癥的 IgM［11］，高脂血癥中的脂蛋白［12，13］。日本較多報道用于丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的治療，主要通過這種方法大量清除血液中的HCVRNA病毒顆粒，從而降低體內(nèi)病毒負(fù)荷，提高患者對后續(xù)藥物治療的反應(yīng)性［14－16］。Hanafusa 等［7］采用這種方法治療，IgG下降率18.6% ～21.9%，而LDL下降率則達(dá)63.7% ～65.6%，與本文結(jié)果相同。而自身免疫性疾病的致病性抗體，如ANCA，多為IgG型，少有IgM及IgA型自身抗體，如部分抗心磷脂抗體及類風(fēng)濕因子。因此針對IgG型自身抗體，采用MPS07/EC50W組合并不合適。第二種選擇為MPS07/EC20W組合方式。從本文結(jié)果可知，這種方式對血漿中除白蛋白以外大分子蛋白清除都較顯著，特別是IgM及IgA。而對于多數(shù)自身免疫性疾病患者而言，欲清除物質(zhì)主要是IgG，采用這種方式治療必然帶來大量大分子蛋白的丟失，如IgM，IgA和一些大分子凝血物質(zhì)。Tanabe［17］采用類似方式治療患者在清除IgG達(dá)60%的同時，也清除70%的IgM。Hanafusa等［7］采用同樣組合方式治療可使患者血液中凝血因子Ⅷ活性嚴(yán)重降低。

為進(jìn)一步提高清除物質(zhì)的選擇性，本文提出了EC50W/EC20W組合方式，即采用一個膜孔相對較大的血漿成分分離器作一級濾器，一個膜孔徑相對較小的血漿成分分離器作二級濾器。EC50W作為一級濾器，只分離血液中欲清除的IgG，而不需清除的物質(zhì)如IgM則不被分離，亦不被二級濾器所清除。因此采用這種方式治療后，對IgM水平無明顯影響。且每次治療只需補(bǔ)充人體白蛋白30～40g(相當(dāng)于血漿800～1 000 ml)，可使血漿IgG下降43.5%，MPO－ANCA滴度下降34.6%，對IgG的清除指數(shù)較白蛋白清除指數(shù)高1.6倍。雖然本文未測定對凝血因子的影響，但可推測與IgM分子量相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)可被大量保留，從而進(jìn)一步減少有用物質(zhì)的丟失，減少DFPP相關(guān)并發(fā)癥。通過相關(guān)文獻(xiàn)檢索，本文所提出的這種組合方式還未見國內(nèi)外其他作者報道。當(dāng)然，采用這種方式單次治療IgG下降率略低于傳統(tǒng)方式［(43.5±13.8)%vs(51.0±10.0)%，P ＞0.05］，但奇怪的是ANCA水平的下降率則無明顯差別［(34.6±14.3)%vs(31.1±14.0)%，P ＞0.05］。

目前臨床所使用的DFPP方法一般采用兩種棄漿方式，即連續(xù)式和間斷式棄漿方式。前者即一級濾器分離出血漿以30～40 ml/min的速率進(jìn)入二級濾器中被再次濾過，不能濾過的蛋白在二級濾器中被濃縮，濃縮液被以3～4 ml/min的速率連續(xù)丟棄;而間斷式棄漿方式則不連續(xù)丟棄濃縮液，使之不斷被濃集，二級濾器壓力逐步升高，當(dāng)壓力達(dá)到一定程度，即用生理鹽水將二級濾器中滯留的蛋白沖入棄漿袋中丟棄。我們發(fā)現(xiàn)，在廢棄血漿中白蛋白濃度仍較高，如能將之再過濾，必可進(jìn)一步減少白蛋白丟失。因此本文在采用間斷棄漿方式基礎(chǔ)上作了兩點(diǎn)改進(jìn):一是增加了再循環(huán)泵，使二級濾器中的濃縮液不斷再循環(huán)，不至于堵塞二級濾器導(dǎo)致效率降低;二是在二級濾器壓力升高達(dá)到閾值后，并不直接棄漿，而是采用生理鹽水將其再濾過后才棄漿。通過這種改進(jìn)發(fā)現(xiàn)，可使二級濾器中白蛋白濃度降低42%，IgG降低28.2%，使濾器中IgG/白蛋白濃度比升高24.2%，即進(jìn)一步減少了白蛋白的丟失。Jiang等［18］報道DFPP治療頑固性蕁麻疹，在補(bǔ)充20g人體白蛋白情況下，患者血漿白蛋白從35.4 g/L顯著降至21.8 g/L。而Ramumni等報道的DFPP治療單次IgG下降率僅為28.8%［19］。與這些報道結(jié)果相比，本文提出的改進(jìn)DFPP方法在只需補(bǔ)充人體白蛋白30～40g情況下對血漿白蛋白無影響，且獲得較好的IgG下降率及有效降低MPO－ANCA滴度。

本文還觀察到IgG與ANCA水平下降不平行，即部分患者治療前后IgG下降幅度很大，而ANCA水平則無明顯下降。本文表1結(jié)果也顯示，MPS07/EC20W組IgG下降率高于EC50W/EC20W組［(51.0±10.0)%vs(43.5±13.8)%，P ＞0.05］，但其 MPO－ANCA下降率反不如后者［(31.1±14.0)%vs(34.6±14.3)%，P ＞0.05］。造成這些現(xiàn)象的具體原因尚不清楚。在這部分患者棄去廢血漿中亦檢出大量ANCA被清除。我們推測可能與ANCA的體內(nèi)分布有關(guān):有的患者ANCA主要存在于循環(huán)中，因此血IgG與ANCA平行下降;而有的患者ANCA則可能大量沉積于組織，當(dāng)血液中水平略有下降時，組織中ANCA即重新進(jìn)入循環(huán)，導(dǎo)致循環(huán)中ANCA水平變化不明顯。

小結(jié):DFPP是一種能有效清除血液中致病性大分子物質(zhì)的血液凈化方法，且需補(bǔ)充蛋白量少，值得臨床推廣使用。臨床應(yīng)根據(jù)欲清除的致病性物質(zhì)特性來選擇不同一級濾器及二級濾器。針對血管炎致病性抗體MPO－ANCA，筆者提出以血漿成分分離器EC50W作一級濾器，EC20W作二級濾器的新組合方式，改進(jìn)了原有的DFPP方法，同時證實進(jìn)一步增加了DFPP清除物質(zhì)的選擇性，避免有用大分子物質(zhì)丟失，但可能輕度降低IgG下降率。臨床觀察可有效降低患者血清MPO－ANCA滴度，但對患者臨床癥狀及預(yù)后的影響還需擴(kuò)大病例及進(jìn)一步的研究觀察。

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