失血性休克的大鼠腸系膜動(dòng)脈節(jié)律基因表達(dá)的變化＊

張惠琴 謝一舟 田國華 劉延友 汪宇輝 江舟 王正榮

(衛(wèi)生部時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心,四川 成都 610041)

生物體內(nèi)多數(shù)生理過程都存在約為24 h的周期變化,即近日節(jié)律(Circadian rhythm),近日節(jié)律是生命活動(dòng)的基本現(xiàn)象之一[1],從簡單的單細(xì)胞動(dòng)物到復(fù)雜的哺乳動(dòng)物均存在近日節(jié)律。在哺乳動(dòng)物中,這些基因包括 Per1、Per2、Clock、Bmal1、Cry 1、Cry 2和 Tim等[2-3]。其中Per1作為近日節(jié)律振蕩器的核心組件,不僅在近日節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)控中占有重要地位,還與免疫系統(tǒng)疾病和藥物依賴及腫瘤發(fā)生息息相關(guān)[5-6]。失血性休克時(shí)生理指標(biāo)如呼吸、心率和血壓等重要指標(biāo)的節(jié)律發(fā)生紊亂[7]。本研究以失血性休克大鼠為動(dòng)物模型[8-9],初步探討其腸系膜上動(dòng)脈節(jié)律基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠,4-6 w,體重250-300g,20只?？刂骑曫B(yǎng)及實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件(溫度：22℃、濕度 55%、光照循環(huán)12：12),自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.2 試劑及儀器

Trizol(Invitrogen);RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);引物序列(上海生物工程有限公司),序列見表 1。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制作

SD雄性大鼠20只,實(shí)驗(yàn)前禁食24 h,禁水12 h。動(dòng)物隨機(jī)分為休克組和空白對(duì)照組,休克組在10min內(nèi)經(jīng)股動(dòng)脈放血使血壓降至5.32 kPa(40 mmHg),并維持大鼠平均動(dòng)脈壓在40 mmHg 30min,造模成功。正常對(duì)照組大鼠除不通過股動(dòng)脈放血致休克外,其余同休克組。

1.2.2 RT-PCR檢測SMA的per1,per2mRNA的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)2 h后,處死大鼠,快速分離SMA。按 Trizol法提取組織總RNA,采用半定量RT-PCR特異性擴(kuò)增 per1與per2 mRNA檢測其表達(dá)水平變化。所有反應(yīng)均以GAPDH為內(nèi)參照在同一擴(kuò)增條件下進(jìn)行。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段長度

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)按20 μ l體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),poly(A)mRNA 1 μ l,buffer 4 μ l,Oligo(dt)primer 1 μ l,10 Mm dNTP Mix 2 μ l,RNase inhibitor 1 μ l,RNA 1 μ l,加 滅 菌雙 蒸水 到20 μ l混勻,反應(yīng)條件為：65℃,5min;42℃,60min;25℃,5min。

PCR擴(kuò)增per1、per2基因 PCR 反應(yīng)體系為 20 μ l,取 cDNA1 μ l,加入 Taq Master Mix 9 μ l,目的基因及內(nèi)參照 GAPDH 上下游引物各 1.5 μ l,滅菌雙蒸水 7 μ l。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min后按照94℃30 s;53℃30 s;72℃30 s共35個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后72℃延伸10min。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR產(chǎn)物電泳鑒定

瓊脂糖電泳鑒定大鼠失血性休克后SMA的per1、per2基因表達(dá)水平,RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。用凝膠分析方法可看出休克組per1、per2比對(duì)照組per1、per2的條帶均明顯變淡。

2.2 SMA節(jié)律基因per1、per2RT-PCR產(chǎn)物的定量檢測

通過對(duì)休克組和對(duì)照組的per1的mRNA量的比對(duì),可看出：與對(duì)照組相比,休克組明顯減低(如圖2),方差分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。通過對(duì)休克組和對(duì)照組的per2的mRNA量的比對(duì),可看出：與對(duì)照組相比,休克組明顯減低(如圖2.2),方差分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.004)。

圖1 休克組和對(duì)照組的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 SMA節(jié)律基因 per1、per2的定量檢測

3 討論

在失血性休克病理?xiàng)l件下per1、per2基因表達(dá)變化規(guī)律,國內(nèi)外文獻(xiàn)尚缺乏相關(guān)報(bào)道。從基因水平探討節(jié)律基因在失血性休克的變化規(guī)律,將促進(jìn)節(jié)律基因功能與失血性休克防治研究進(jìn)一步深入。為此,本研究采用大鼠失血性休克動(dòng)物模型,利用RT-PCR技術(shù)對(duì)腸系膜上動(dòng)脈 per1、per2基因轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示大鼠失血性休克后per1、per2均顯著低于正常對(duì)照組,表明在失血性休克大鼠中節(jié)律基因表達(dá)發(fā)生明顯改變。推測 per1、per2節(jié)律基因表達(dá)明顯降低后,引起一系列重要器官的節(jié)律功能紊亂,加劇了失血性休克的發(fā)生發(fā)展過程,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 劉延友,王正榮.生物節(jié)律系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].西部醫(yī)學(xué),2007,19(2)：161-162.

2 Young MW,Kay SA.Time zones：a comparative genetics of circadian clocks[J].Nat Rev Genet,2001,2(9)：702-715.

3 Etchegaray JP,Lee C,Wade PA,et al.Rhy thmic histone acetylation underlies transcription in the mammalian circadian clock[J].Nature,2003,421(2)：177-182.

4 Boivin DB,James FO,Wu A,et al.Circadian clock genes oscillate in human peripheral blood mononuclear cells[J].Blood,2003,102(12)：4143-4145.

5 王躍锜,周薇,劉延友,等.節(jié)律基因Period1對(duì)嗎啡依賴效應(yīng)的影響[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程,2004,17(5)：383-385.

6 Murga Penas EM,Cools J,Algenstaedt P,et al.A novel cryptic translocation t(12;17)(p13;p12-p13)in a secondary acute myeloid leukemia results in a fusion of the ETV6 gene and the antisense strand of the PER1 gene[J].Genes Chromosomes Cancer,2003,37(1)：79-83.

7 陳主初主編.病理生理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001,263-295.

8 Li YC,Okuda C,Mixobe T,et al.Measurements of glucose and lactate with microdialysis probes in blood,liver and muscle of the rat during henrorrhagic shock[J].J Kyoto Pref Univ Med,1989,98(9)：931-939.

9 陳銳,劉友生,王水明.失血性休克大鼠心肌和腸上皮細(xì)胞ND1 ND2 mtTFA基因表達(dá)的變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(16)：1432-1435.