林下參根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究

張亞玉，孫 海，宋曉霞，汪景寬

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽110161；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 吉林132109）

林下參是將人參種子撒播到林地，任其自然生長(zhǎng)，若干年后進(jìn)行采挖的仿野生人參，發(fā)展林下參是目前人參產(chǎn)業(yè)的主要生產(chǎn)模式，但在林下參發(fā)展過程中，由于選地不當(dāng)，造成林下參的存苗率低，根形變劣的現(xiàn)象普遍，給廣大參戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也制約了林下參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。前人對(duì)于林下參的生態(tài)環(huán)境進(jìn)行了較詳細(xì)的描述，對(duì)林下參適宜生長(zhǎng)的林種［1－2］、光照［3］、水分及土壤類型等進(jìn)行了調(diào)查研究；鐘偉麗等［4］、鄭毅男［5］對(duì)林下參種子油、總皂苷含量及單體皂苷進(jìn)行了測(cè)試研究，孫海［6］報(bào)道了林下參根區(qū)土壤的無機(jī)養(yǎng)分狀況，為林下參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了有利指導(dǎo)，但對(duì)于林下參土壤微生物的相應(yīng)研究尚未見報(bào)道，土壤微生物群落被認(rèn)為是土壤生態(tài)系統(tǒng)的預(yù)警及敏感指標(biāo)，指示土壤質(zhì)量變化，決定著土壤的生態(tài)功能。本文利用磷脂脂肪酸法（PLFA）對(duì)5，10，15，20，25年生林下參根區(qū)土壤的微生物結(jié)構(gòu)特征及變化趨勢(shì)進(jìn)行了分析研究，期望為林下參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和農(nóng)田栽參的改土提供些許參考。

1 材料與方法

1.1 材料

林下參根區(qū)土壤采自人參之鄉(xiāng)的吉林省撫松縣露水河鎮(zhèn)吳杰野山參護(hù)育基地，該區(qū)位于東經(jīng)127°46′，北緯42°48′，屬山區(qū)濕潤(rùn)氣候，海拔520m，土壤屬暗棕壤，選擇同一坡度、同一坡位、同一坡向生長(zhǎng)的大致年限在5，10，15，20，25年生林下參，將蘆頭以上的土壤剝?nèi)ィ杉瘏⒏苓呁寥溃?～10cm），邊挖參邊取土，5，10，15年取3株混合，20，25年取2株混合，同時(shí)采集未生長(zhǎng)人參的土壤作為對(duì)照。將土壤裝入封口塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱保存。

1.2 方法

采用改進(jìn)的White［7］方法提取磷脂脂肪酸，基本步驟為：（1）稱4g新鮮土樣于玻璃離心管中，加入4 ml檸檬酸緩沖液，5ml氯仿，10ml甲醇，25℃避光震蕩4h，離心15min。（2）轉(zhuǎn)移上清液到25ml試管中，加1.6ml檸檬酸緩沖液，2ml氯仿，4ml甲醇進(jìn)行第2次提取，震蕩2h，離心15min。（3）上清液合并，加7ml檸檬酸緩沖液，7ml氯仿，震蕩5min，避光保存18h。（4）經(jīng)18h分離后，吸走上層液，下層液轉(zhuǎn)移到新試管中，氮?dú)獯蹈?。?）用柱層析硅膠0.8g（在120℃下烘干2h）填充玻璃管柱（直徑6 mm），10ml氯仿洗柱后，用5ml氯仿溶解樣品并注入硅膠柱中。加10ml氯仿和10ml丙酮依次洗脫，去除中性脂和糖脂。最后用10ml甲醇洗脫磷脂脂肪酸于10ml離心管中，在氮?dú)饬飨麓蹈蓸悠贰＃?）向干樣品中加入1ml甲醇：甲苯（1∶1）混合液，溶解脂類，再加1ml 0.2mol／L KOH甲醇溶液，37℃水浴15min后，冷卻至室溫，依次加入2ml去離子水，0.3ml 1mol／L醋酸溶液，2ml正己烷，震蕩1min，離心10min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相到10ml樣品瓶中。下層相再加2ml正己烷，重復(fù)上一步驟，合并兩次提取的正己烷相，氮?dú)饬飨麓蹈?，于?0℃下保存。（7）上機(jī)前加入0.05ml甲酯化的C19：0內(nèi)標(biāo)，氮?dú)饬飨麓蹈桑?.15ml正己烷定溶轉(zhuǎn)移至GC內(nèi)插管中待測(cè)。用氣質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測(cè)得到PLFA譜圖。

由安捷倫GC－MS（6890N－5973N）進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為hp5－MS（30m×250um×0.25um）石英毛細(xì)管柱。GC－MS分析條件：升溫程序：進(jìn)樣后在70℃保持0.5min，之后以20℃／min的速率升至190℃，保持1min，以5℃／min的速率上升到200℃，停留2min，以10℃／min的速率上升到280℃，保留8min。進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為 He（0.9ml／min），分流比為10∶1，離子源溫度230℃，四極桿150℃，質(zhì)譜全掃描范圍30～600m／z。

脂肪酸定量用峰面積和內(nèi)標(biāo)曲線法。內(nèi)標(biāo)為甲酯化的 C19：0，外標(biāo)為 SupelcoTM37Component FAME Mix和Bacterial Acid Methl Esters Mix。PLFA含量用nmol／g表示。

脂肪酸鏈長(zhǎng)以碳原子總數(shù)計(jì)算，從羧基開始，冒號(hào)后數(shù)字代表雙鍵數(shù)目，ω后數(shù)字代表雙鍵的位置（從羧基端算起），c表示順勢(shì)雙鍵，t表示反式雙鍵，i表示順勢(shì)支鏈，a表示反勢(shì)支鏈，br表示不確定支鏈位置，Me表示甲基位置，cy表示環(huán)丙基。

表1 磷脂脂肪酸的代表生物

2 結(jié)果與分析

2.1 林下參根區(qū)土壤微生物PLFA圖譜特征

共測(cè)得林下參根區(qū)土壤中脂肪酸種類28種，根區(qū)土壤與非根區(qū)土壤微生物所含脂肪酸種類基本相同。鑒定的PLFAs，C鏈長(zhǎng)度從14～24，包括飽和、不飽和、甲基化分支和環(huán)化脂肪譜。

在5年生林下參根區(qū)土壤的PLFAs中，i15：0，a15：0，15：0，i16：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0，br17：0，i17：0，10Me17：0，cy17：0，18：2，18：1ω9c，18：1ω9t等14種PLFAs豐度較高，是5年林下參根區(qū)土壤微生物的主要成分。根區(qū)中 15：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0摩爾濃度與對(duì)照相比有減少的趨勢(shì)，而代表放線菌種類的10Me17：0的摩爾濃度則由6.88nmol／g增加到12.142nmol／g。

i15：0，a15：0，i16：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0，br17：0，i17：0，18：2，18：1ω9c，18：1ω9t等11種 PLFAs是10年林下參根區(qū)土壤微生物的主要成分。其中a15：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0，18：2，18：1ω9c，18：1ω9t摩爾濃度與對(duì)照相比有減少的趨勢(shì)，而i15：0，i16：0，br17：0，i17：0的摩爾濃度與對(duì)照相比則有增加。

14：0，i15：0，a15：0，i16：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0，br17：0，i17：0，10Me17：0，cy17：0，18：2，18：1ω9c，18：1ω9t等14種PLFAs在15年生根區(qū)土壤中豐度較高，是其微生物的主要成分。在占有優(yōu)勢(shì)組分的14中磷脂脂肪酸的摩爾濃度與對(duì)照相比除15：0，16：1ω9t有減少的趨勢(shì)，其它均有增加的趨勢(shì)。

圖1 林下參土壤磷脂脂肪酸圖譜（a為生長(zhǎng)年限）

在20年生林下護(hù)育山參根區(qū)土壤的PLFAs中，i15：0，a15：0，i16：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0，br17：0，i17：0，10Me17：0，cy17：0，18：2，18：1ω9c，18：1ω9t等13種PLFAs豐度較高，是20年林下山參根區(qū)土壤微生物的主要成分；與對(duì)照相比均有增加的趨勢(shì)。

在25年生林下參根區(qū)土壤的PLFAs中，i15：0，a15：0，15：0，i16：0，16：1ω9c，16：1ω9t，16：0，br17：0，i17：0，10Me17：0，cy17：0，10Me18：0，18：2，18：1ω9c，18：1ω9t等15種PLFAs豐度較高，是25年林下參根區(qū)土壤微生物的主要成分。與20年生林下護(hù)育山參相似，在占有優(yōu)勢(shì)組分的15年中磷脂脂肪酸的摩爾濃度與對(duì)照相比均有增加的趨勢(shì)。25年生與20年生相比根區(qū)土壤中優(yōu)勢(shì)微生物種群增加了代表細(xì)菌的15：0和放線菌的10Me18：0，其它主要種類則未發(fā)生變化，沒有增加新型代表真菌的組成部分，可以推斷，在林下護(hù)育山參生長(zhǎng)過程中，為了不斷適應(yīng)生存環(huán)境，在20年以后林下護(hù)育山參根區(qū)土壤微生物組成基本上保持相對(duì)平衡。

2.2 林下參不同年生根區(qū)土壤PLFA的變化特征

從表2中可以明顯看出林下參根區(qū)土壤微生物磷脂脂肪酸在量上差異較大，其中i15：0，a15：0，18：1ω9t，16：0，16：1ω9c，18：1ω9c，br17：0，18：2ω6，i16：0，16：1ω9t等10種PLFAs在林下參根區(qū)土壤中比例占有優(yōu)勢(shì)地位，在不同年生微生物組成上比較一致，并隨著人參的生長(zhǎng)發(fā)生一定的變化，與對(duì)照根區(qū)土壤微生物組成相比，5年生林下參微生物變化不明顯，而10年和15年生山參根區(qū)土壤微生物數(shù)量和種類的變化較為劇烈，20年與25年生趨于穩(wěn)定，略有變化，但變化的結(jié)果是有益微生物群落比例增加，使人參根區(qū)微生物群落特征朝著有利于人參生長(zhǎng)的方向發(fā)展。

2.3 林下參根區(qū)土壤微生物群落主成分分析

對(duì)不同年生林下參土壤磷脂脂肪酸進(jìn)行主成分分析 （Principal component analysis，PCA），第 一（PCA1）、第二（PCA2）主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為93.76%，其中第一主成分貢獻(xiàn)率為84.9%。其中脂肪酸i15：0，a15：0，16：0，br17：0，18：2ω6和18：1ω9c在第一主成分中貢獻(xiàn)率較高，貢獻(xiàn)率分別為0.366，0.601，0.295，0.255，0.229，0.440。

從主成分分析圖3中可以看出，對(duì)照與5年生和10年生林下護(hù)育山參第一、第二主成分相近，說明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相近，15年和20年、25年生林下參土壤第一主成分距離相近、第二主成分相聚較遠(yuǎn)，說明不同年生土壤中脂肪酸類型在i15：0，a15：0，16：0，br17：0，18：2ω6，18：1ω9c相近，但是也存在脂肪酸的差異，也就是第二主成分中的脂肪酸16：1ω9c的變化，研究表明：16：1ω9c脂肪酸的變化與土壤的pH值的變化呈極顯著正相關(guān)，進(jìn)一步說明了20年后林下參根區(qū)土壤的微生物結(jié)構(gòu)與小年生間發(fā)生了一定的改變，由于人參的生長(zhǎng)其根系的代謝作用，向根區(qū)分泌一定量的酸性有機(jī)物影響著根區(qū)土壤的pH值和有效養(yǎng)分狀況，也直接影響微生物的群落結(jié)構(gòu)特征。

表2 不同年生林下參土壤磷脂脂肪酸變化

2.4 林下參根區(qū)土壤微生物生物量的變化特征研究

從對(duì)不同年生林下參根區(qū)土壤微生物量的分析結(jié)果可以看出，微生物總量有增加的趨勢(shì)，但在大約10生林下參根區(qū)土壤的微生物總量卻在減少，與對(duì)照及不同年生相比數(shù)量明顯減少，而15年生以后微生物總量在不斷增加，明顯高于未栽參的土壤微生物群落組成，在生產(chǎn)實(shí)際中林下參在8～10年間掉苗現(xiàn)象比較嚴(yán)重，是否是人參與其生長(zhǎng)環(huán)境的自然協(xié)調(diào)的關(guān)鍵時(shí)期，有待進(jìn)一步研究。

圖2 不同年生林下護(hù)育山參土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析

不同年生林下參根區(qū)土壤放線菌量的變化特征與微生物總量基本一致，只是一直處于增加的趨勢(shì)，即使是在微生物總量嚴(yán)重降低的10年生左右的林下參根區(qū)土壤，與對(duì)照相比其變化雖不顯著，但趨勢(shì)是增加的，而非降低。大約15年以后，放線菌的量比對(duì)照增加了2倍甚至3倍，20年和25年生放線菌占微生物總量的比率為2.965%和3.63%，明顯高于對(duì)照的2.13%。

表3 林下參土壤微生物量

不同年生林下參根區(qū)土壤細(xì)菌的變化特征與微生物總量完全相同，15年生以后細(xì)菌量也在增加，但增加的幅度在1.5倍以上低于2倍，遠(yuǎn)低于放線菌的增加幅度。不同年生林下參根區(qū)土壤真菌的變化趨勢(shì)亦與微生物總量的變化趨勢(shì)一致，除大約10年生的根區(qū)土壤真菌有降低，其余均有增加，但增加的幅度小于1.5倍；20和25年生真菌占微生物總量的比率分別是25.41%和24.58%與對(duì)照的26.16%相比有減少的趨勢(shì)，可見在林下參生長(zhǎng)過程中，微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，趨于復(fù)雜，趨于穩(wěn)定，更有益于林下參健康生長(zhǎng)。

3 討論

（1）不同年生林下參微生物的多樣性研究結(jié)果表明，在林下參生長(zhǎng)過程中，根區(qū)土壤微生物的種類基本相同，但量上具有一定差異，隨著林下參的生長(zhǎng)，由于根系的代謝作用對(duì)根區(qū)土壤的酸堿度、養(yǎng)分狀況會(huì)有一定的影響作用，導(dǎo)致微生物的組成在量上發(fā)生變化，15年以下的林下參根區(qū)微生物的磷脂脂肪酸種類變化較為不定，對(duì)林下參的生長(zhǎng)影響較大，生產(chǎn)上也存在10年左右保苗率不穩(wěn)定的現(xiàn)象，可能與其根區(qū)土壤微生物的結(jié)構(gòu)具有一定的聯(lián)系，隨著林下參的生長(zhǎng)，根區(qū)土壤微生物的總量不斷增加，群落趨于復(fù)雜，微生物的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，有利于林下參的健康生長(zhǎng)。

（2）從對(duì)林下參根區(qū)土壤的細(xì)菌、放線菌及真菌變化情況的分析發(fā)現(xiàn)，20年及25年林下參根區(qū)土壤的微生物的群落結(jié)構(gòu)特征變化是放線菌占微生物總量的比率為2.965%和3.63%，明顯高于對(duì)照的2.13%；真菌占微生物總量的比率分別是25.41%和24.58%，低于對(duì)照的26.16%。由于在人參生長(zhǎng)過程中多數(shù)病害的發(fā)生是由于真菌的感染導(dǎo)致的［10］，真菌的增加是老參地土壤性狀變劣的主要原因［11－12］，而放線菌是人參生長(zhǎng)的有益菌對(duì)改善人參土壤微環(huán)境和提高人參的產(chǎn)量、質(zhì)量和抗病性均具有一定的改善作用?？梢娏窒聟⑼寥牢⑸锏慕Y(jié)構(gòu)變化是朝著有益于人參健康生長(zhǎng)的方向發(fā)展。

（3）Bardgett［13］等認(rèn)為土壤中磷脂脂肪酸的組成可以表示土壤微生物群落的生物量和結(jié)構(gòu)。不同菌群的磷脂脂肪酸圖譜不同，可以作為微生物群落中不同群體的標(biāo)記物，微生物的生物量可以通過脂肪酸的含量來估算。人參土壤微生物的研究目前還沒有利用土壤中磷脂脂肪酸的組成進(jìn)行描述研究，本文利用PFLA法研究了林下參根區(qū)土壤微生物多樣性，克服了以往在人參土壤微生物的研究上采用的傳統(tǒng)培養(yǎng)法的諸多不足，提供了較為準(zhǔn)確的土壤微生物結(jié)構(gòu)狀況。是對(duì)林下參研究系統(tǒng)的完善，也是對(duì)野山參研究的補(bǔ)充，更能為農(nóng)田栽參科學(xué)改土提供指導(dǎo)，具有較大的生產(chǎn)意義。

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