AQC柱前衍生高效液相色譜法測定胃樂寧片中游離氨基酸

王亞超，曹 玲，王 玉，

(1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009;2.江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 南京 210008)

猴頭菌[Hericium erinaceus(Rull ex F.)Pers.]又名猴頭菇、剌菌或猬菌，是最早加工成中成藥的藥用菌之一，因用子實(shí)體作原料成本較高，生產(chǎn)中多用固體培養(yǎng)的菌絲體代替子實(shí)體作原料。胃樂寧片系猴頭菌絲體加工制成，被列為“中藥保護(hù)品種”目錄，具有養(yǎng)陰和胃功效，用于胃、十二指腸潰瘍和慢性萎縮性胃炎等癥。和多數(shù)藥用真菌一樣，猴頭菌絲體中含有豐富的氨基酸成分，不同種類的氨基酸功效各異，對(duì)人體具有十分重要的生理作用[1]，2010年版中國藥典[2]加強(qiáng)了對(duì)真菌類藥物中氨基酸成分的質(zhì)量控制。曾有文獻(xiàn)報(bào)道過猴頭菌中氨基酸的測定[3-4]，但主要是測定其中的水解氨基酸，操作復(fù)雜，適用性差，對(duì)游離氨基酸的研究未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種柱前衍生高效液相色譜法，對(duì)包括天門冬酰胺和谷氨酰胺在內(nèi)的21種常見氨基酸進(jìn)行定量測定。

1 儀器和試藥

Agilent 1100 series高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器;JL-720 DT型超聲清洗器，上海杰理科技有限公司;EYELA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司。

胃樂寧片由南京市老山藥業(yè)股份有限公司提供;21種對(duì)照品[天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、胱氨酸(Cys2)和 γ-氨基丁酸(GABA)]，中國藥品生物制品檢定所;內(nèi)標(biāo)α-氨基丁酸(α-aminobutyric acid)，美國Sigma公司;AccQ·Fluor氨基酸衍生試劑盒，美國Waters公司。乙腈為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相 A:0.14 mol/L 醋酸銨緩沖液(用冰醋酸調(diào) pH 5.10)，流動(dòng)相 B:乙腈-水(57∶43);柱溫 30℃，檢測波長 248 nm，進(jìn)樣量5 μL。按表1進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明在此色譜條件下21種氨基酸可以獲得良好分離，分離結(jié)果見圖1。

表1 梯度洗脫表Tab.1 The gradient elution

圖1 21種混合氨基酸對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of 21 amino acid standards(A)and sample(B)

2.2 試液制備

2.2.1 衍生化試劑制備 精密量取AccQ·Fluor 2B試劑1 mL，加入含衍生化試劑的AccQ·Fluor 2A瓶中，加蓋密封，旋渦混合10 s，55℃加熱10 min，直至衍生化試劑粉末全部溶解，即得濃度10 mmol/L的AccQ·Fluor衍生化試劑，置干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)液的制備 混合儲(chǔ)備液:分別取 18 種氨基酸(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Arg、Ala、Pro、Tyr、Cys2、Val、Met、Ile、Leu、Lys、Phe 和GABA)適量，精密稱定，置于同一50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，制成濃度均約為5 mmol/L(胱氨酸的濃度約為2.5 mmol/L)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃保存?zhèn)溆谩ln、Asn和Trp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液臨用前單獨(dú)配制，濃度均約為5 mmol/L。

內(nèi)標(biāo)液:取α-氨基丁酸約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，混勻。

2.3 供試品制備及衍生化反應(yīng)

取本品30片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)混勻，取粉末0.5 g，精密稱定，加60%乙醇30 mL，超聲(功率250 W，頻率100 kHz)提取30 min，離心，殘?jiān)?0%乙醇25 mL同法重復(fù)提取一次，殘?jiān)B同濾紙用60%乙醇洗滌3次，每次3 mL，合并提取液和洗滌液，旋轉(zhuǎn)濃縮至干，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)液200 μL，稀釋至刻度。用0.45 μm 濾膜濾過，精密吸取續(xù)濾液10 μL，置小試管中，精密加入硼酸鹽緩沖液70 μL，渦旋混勻，立即精密加入衍生化試劑20 μL，渦旋反應(yīng)30 s，即得。

2.4 線性關(guān)系和最低檢測限

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和Gln、Asn、Trp標(biāo)準(zhǔn)液適量，加入內(nèi)標(biāo)液適量，制成各種氨基酸濃度均約為0.01，0.02，0.05，0.10，0.25，0.50 mmol/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取10 μL，置小試管中，精密加入硼酸鹽緩沖液70 μL，渦旋混勻，立即精密加入衍生化試劑 20 μL，渦旋反應(yīng) 30 s，分別取 5 μL，注入色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以各種氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)y，各氨基酸濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)x，線性回歸得到的線性方程見表2。結(jié)果表明，21種氨基酸在0.5～0.01 mmol/L范圍內(nèi)與峰面積比具有良好的線性關(guān)系。將0.01 mmol/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液逐步稀釋后衍生化反應(yīng)，量取5 μL注入色譜儀，以S/N=3確定最低檢測限，得到21種氨基酸的檢出限，見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)

取加入標(biāo)樣的供試品溶液，進(jìn)行衍生化反應(yīng)和色譜分析，平行進(jìn)樣 5 次，并分別在 0，2，4，8，12 和24 h進(jìn)樣，根據(jù)各氨基酸色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，計(jì)算RSD，以考察其精密度和穩(wěn)定性，21種氨基酸的精密度試驗(yàn) RSD在0.41% ～2.48%(n=5)，穩(wěn)定性試驗(yàn) RSD 在 0.11% ～2.32%(n=5)。另取同一批胃樂寧片粉末6份，按2.3項(xiàng)方法進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)和色譜分析，根據(jù)各種氨基酸的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，計(jì)算RSD，以考察方法的重復(fù)性，21種氨基酸峰重復(fù)性試驗(yàn)RSD在0.65%～3.26%(n=6)。

2.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品粉末約0.25 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入各氨基酸儲(chǔ)備液100 μL，分別進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)和色譜分析，計(jì)算各種氨基酸的加樣回收率和RSD。結(jié)果見表2，平均回收率在91.5% ～107.0%，RSD 在 0.63% ～3.79%。

表2 21種氨基酸的線性方程、檢測限與回收率(n=6)Tab.2 Regression equations，LOD and recoveries of 21 amino acids(n=6)

表3 供試品測定結(jié)果Tab.3 Results of sample determination

2.7 供試品測定結(jié)果

取供試品兩份，按2.3項(xiàng)下制備方法進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)，分別取5 μL，注入色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

3 討論

樣品測定結(jié)果顯示，各批次樣品中的游離氨基酸均以Arg含量最高，占游離氨基酸總量的20%以上，Ala含量次之，其中 His、Cys2、Met和 Gln 由于含量低于檢測限而未能檢出，不同批次的樣品之間各種氨基酸的含量具有一定的差異，可以為深入開展其質(zhì)量研究提供依據(jù)。

據(jù)報(bào)道[5-7]，目前提取游離氨基酸的提取溶劑主要有水、乙醇水溶液等。本試驗(yàn)分別考察了水、40%，50%，60%和70%乙醇等5種提取溶劑經(jīng)超聲提取情況，結(jié)果顯示，水提取物中含有的水溶性蛋白給濃縮等后續(xù)樣品處理以及衍生化反應(yīng)和色譜分析等過程均造成了干擾，提取溶劑中加入乙醇可消除干擾，且隨著乙醇濃度的增加提取的氨基酸的含量也略有增加，但乙醇濃度增至70%時(shí)反而有所下降，可能是乙醇濃度過高不利于極性氨基酸如Arg的提取，故選擇60%乙醇溶液作為提取溶劑。

酰胺類氨基酸的檢測歷來是分析的難點(diǎn)[8]，本法在Waters公司的AQC衍生化氨基酸分析方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，只需精確控制緩沖液的pH值即可。在色譜分離過程中有三個(gè)關(guān)鍵色譜峰對(duì)，其中Glu/Asn峰對(duì)對(duì)pH變化很敏感，當(dāng)pH值由5.00變?yōu)?.10時(shí)，Glu/Asn峰對(duì)由相互重疊逐漸達(dá)到完全分離，而His/Gly和NH3/Ala峰對(duì)的分離略微受到影響;同時(shí)NH3/Ala峰對(duì)對(duì)有機(jī)相比例變化較敏感，通過試驗(yàn)將有機(jī)相組成確定乙腈-水(57∶43)。這三組峰對(duì)的保留時(shí)間均比較小，進(jìn)樣后可先以較小流速洗脫再增加流速，以進(jìn)一步改善分離效果，使三組峰對(duì)均能達(dá)到基線分離。

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