褪黑素改善胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取

佘美華，侯洪杰，胡小波，尹衛(wèi)東

(南華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，湖南 衡陽(yáng) 421001)

褪黑素(melatonin，MLT)是松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，研究證實(shí)它參與了體內(nèi)物質(zhì)和能量的代謝。研究顯示MLT從多個(gè)方面對(duì)糖尿病及其慢性并發(fā)癥提供保護(hù)作用，可能參與了調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)。本課題以3T3-L1脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用游離脂肪酸(FFA，棕櫚酸)來(lái)誘導(dǎo)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，測(cè)定細(xì)胞葡萄糖攝取能力以及MLT的作用。

1 材料

MLT(純度＞99%)由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供;3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心;DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州賽樂(lè)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%FBS、1×105u/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)傳代和收集，待細(xì)胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、1 μmol/L 地塞米松、5 μg/mL胰島素、含10%FBS的DMEM培養(yǎng)48 h，再換以含5 μg/mL胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)96 h，中間換液一次，隨后以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，油紅O染色后顯微鏡下觀察。誘導(dǎo)分化8～12 d的3T3-L1細(xì)胞90%多呈脂肪細(xì)胞表型，可用于研究。

2.2 MLT對(duì)FFA誘導(dǎo)的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

將誘導(dǎo)成功的脂肪細(xì)胞用FFA(300 μmol/L棕櫚酸)或不用 FFA處理6 h，然后用50，100，200 nmol/L胰島素誘導(dǎo)進(jìn)行葡萄糖攝取的研究。液體閃爍儀測(cè)定各組細(xì)胞的葡萄糖攝取能力[1]。根據(jù)抑制程度選擇最佳胰島素作用濃度。

FFA處理脂肪細(xì)胞6 h，處理結(jié)束前30 min加入胰島素或(和)MLT(10 nmol/L)處理共孵育至結(jié)束，測(cè)定各組細(xì)胞的葡萄糖攝取能力。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 3T3-L1細(xì)胞分化前和分化成熟后形態(tài)學(xué)的變化和比較

誘導(dǎo)分化前的3T3-L1細(xì)胞呈梭形、胞漿中無(wú)脂滴，表現(xiàn)為纖維母樣的前脂肪細(xì)胞形態(tài)(圖1A)。誘導(dǎo)分化10 d后，90%的3T3-L1細(xì)胞都分化為成熟的脂肪細(xì)胞，細(xì)胞增大，呈圓形，胞漿豐富，含有大量的脂滴(圖1B)，油紅O染色顯示脂滴富集于核周，形成“戒環(huán)樣”結(jié)構(gòu)，呈典型的成熟脂肪細(xì)胞的形態(tài)(圖1C)。

圖1 3T3-L1細(xì)胞分化前和分化成熟后形態(tài)Fig.1 Morphous of 3T3-L1 adeadipocytes and adipocytes

3.2 FFA對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響

3T3-L1脂肪細(xì)胞在加或不加FFA處理6 h后，分別用不同濃度胰島素誘導(dǎo)檢測(cè)其葡萄糖攝取能力，結(jié)果見(jiàn)表1。未加處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞隨著胰島素濃度的增加其葡萄糖攝取量逐漸增加;而在較低濃度胰島素刺激下，F(xiàn)FA處理的脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入量變化不明顯，當(dāng)胰島素濃度增加到200 nmol/L時(shí)其攝取量增加，但仍顯著的低于未處理組(P＜0.01)。當(dāng)胰島素濃度為100 nmol/L時(shí)，F(xiàn)FA處理組和未處理組細(xì)胞的葡萄糖攝入差別尤為明顯。

3.3 MLT對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響

FFA處理6 h后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，分別接受不同處理，各組細(xì)胞的葡萄糖攝取能力結(jié)果如表2。與未經(jīng)處理組相比，F(xiàn)FA各處理組的攝取能力均降低，配對(duì)檢驗(yàn)的結(jié)果顯示各組間差異顯著(P＜0.05);對(duì)于FFA處理組，MLT和胰島素聯(lián)合使用時(shí)，葡萄糖的攝取明顯高于單獨(dú)使用胰島素時(shí)(P＜0.05)，說(shuō)明MLT能顯著促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取能力，而這一作用在對(duì)照組并無(wú)體現(xiàn)。

表1 FFA對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響(，n=3)Tab.1 Effects of FFA on the glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes(，n=3)

表1 FFA對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響(，n=3)Tab.1 Effects of FFA on the glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes(，n=3)

與正常細(xì)胞比較:1P＜0.01 1P ＜0.01 vs normal adipocytes

胰島素濃度/(nmol/L)葡糖糖攝取/(cpm)正常細(xì)胞 FFA處理細(xì)胞01413.2 ±14.5 994.5 ±75.450 2243.9 ±127.4 1170.7 ±39.31 100 4146.3 ±118.4 1292.7 ±106.21 200 4829.3 ±95.1 2487.8 ±153.81

4 討論

近年來(lái)有關(guān)FFA與2型糖尿病(2-DM)的研究成為熱點(diǎn)，Boden等[2]指出2-DM中糖代謝紊亂的根源是脂代謝紊亂，認(rèn)為循環(huán)中FFA濃度過(guò)高以及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)多，既導(dǎo)致β細(xì)胞分泌胰島素功能缺陷，又產(chǎn)生胰島素抵抗，即FFA的“脂毒性”作用，提議更名2-DM為“糖脂病”。

表2 MLT對(duì)FFA誘導(dǎo)的3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響(，n=3)Tab.2 Effect of MLT on the glucose uptake in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes induced by FFA(，n=3)

表2 MLT對(duì)FFA誘導(dǎo)的3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響(，n=3)Tab.2 Effect of MLT on the glucose uptake in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes induced by FFA(，n=3)

與生理鹽水組比較:1P＜0.05;與胰島素組比較:2P＜0.05;與正常細(xì)胞比較:3P＜0.051P ＜0.05 vs saline group;2P ＜0.05 vs insulin group;3P ＜0.05 vs normal adipocytes

組 別 葡萄糖攝取/(cpm)正常細(xì)胞 FFA 處理細(xì)胞生理鹽水組 1413.2 ±14.5 994.5 ±75.43胰島素組 3832.0 ±106.011914.0 ±118.43胰島素 +MLT 組 3937.0 ±29.01 2832.0 ±130.61，2，3

我們以分化成熟的脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用FFA孵育細(xì)胞，試圖誘導(dǎo)建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FFA(300 μmol/L棕櫚酸)處理6 h后，葡萄糖的攝取結(jié)果顯示，對(duì)照組3T3-L1脂肪細(xì)胞(正常細(xì)胞)隨著胰島素濃度的增加其葡萄糖攝取量是逐漸增加的，而FFA處理的脂肪細(xì)胞則增加緩慢;無(wú)論是基礎(chǔ)狀態(tài)下的還是胰島素刺激的葡萄糖攝取，F(xiàn)FA處理組細(xì)胞的攝取能力都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，尤其是當(dāng)胰島素刺激濃度為100 nmol/L時(shí)，F(xiàn)FA處理細(xì)胞的葡萄攝取率較對(duì)照組降低了60%以上。這說(shuō)明3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取受到FFA的抑制，胰島素抵抗模型建立成功。

進(jìn)一步用MLT孵育上述胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLT能逆轉(zhuǎn)上述FFA誘導(dǎo)的胰島素抵抗現(xiàn)象，使胰島素(100 nmol/L)刺激的葡萄糖攝取量分別增加77.7%。我們已發(fā)現(xiàn)MLT能提高高糖高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠對(duì)胰島素的反應(yīng)性，大量的文獻(xiàn)報(bào)道也證實(shí)MLT的這一作用[3]。另外，對(duì)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞，MLT并不影響其對(duì)葡萄糖的攝取能力。在肥胖Zucker大鼠中，接受長(zhǎng)時(shí)間光照的大鼠，其體重高于短光周期環(huán)境下飼養(yǎng)的大鼠，而這一光照變化所導(dǎo)致的體重差異并不見(jiàn)于瘦的大鼠;MLT能降低中年大鼠的體重，而年輕的成年Wistar大鼠則不受光照或者M(jìn)LT處理的影響[4-6]。這些資料表明，MLT對(duì)體重正常的大鼠并沒(méi)有作用，它只能改變已經(jīng)超重大鼠的體重和脂肪含量，而由于肥胖往往伴有代謝的紊亂和胰島素敏感性的低下。鑒于此，推測(cè)MLT在改善代謝紊亂時(shí)也有“選擇性”，即可能只作用于已經(jīng)發(fā)生了代謝紊亂的動(dòng)物。因而，在本研究中MLT只是改善了FFA誘導(dǎo)的胰島素抵抗細(xì)胞的胰島素敏感性，而并不影響正常3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)性。

FFA可在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的多個(gè)位點(diǎn)抑制胰島素信號(hào)傳遞，降低靶細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，引起骨骼肌和脂肪細(xì)胞胰島素抵抗和糖代謝障礙[5]。Griffin等[7]發(fā)現(xiàn)FFA可以增加 IRS-1的絲氨酸(蘇氨酸)磷酸化，并因此降低肌肉IRS-1偶連的PI3K活性。而IRS-1偶聯(lián)PI3K是骨骼肌中胰島素信號(hào)的重要調(diào)節(jié)物，胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖原合成酶的活性均與此酶的激活相關(guān)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體，在脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞中為GLUT-4亞型，胰島素刺激GLUT-4在脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞的表達(dá)以及向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)葡萄糖分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行分解或合成糖原。Michal等[8]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)水平也是FFA誘導(dǎo)胰島素抵抗的作用位點(diǎn)，因?yàn)檠芯匡@示高濃度FFA可以直接抑制心肌GLUT-4和過(guò)氧化物酶體增生物激活受體-γ(PPARγ)的基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。那么，MLT是否通過(guò)以上途徑調(diào)節(jié)了脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取呢?我們將作進(jìn)一步研究。

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