毛蚶多肽提取物的體外免疫活性

黃演君，宋麗艷，于榮敏

(暨南大學(xué) 藥學(xué)院 1.天然藥物化學(xué)教研室;2.藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

毛蚶(Arca subcrenata Lischke)，軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，蚶目，蚶科，毛蚶屬，主要分布于中國(guó)、朝鮮和日本沿海[1]。毛蚶的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值較高，其殼和肉皆有藥用價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為其性溫味甘，歸脾、肝經(jīng)，具溫中健胃、滋陰補(bǔ)血之功效，臨床上主治貧血、體虛等[2]。目前對(duì)毛蚶活性成分的研究多為毛蚶多糖、多肽這兩類大分子物質(zhì)。何赟綿等[3]從毛蚶中分離到一種多糖精品，并發(fā)現(xiàn)其能顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖;王莉等[4]報(bào)道了毛蚶多糖對(duì)正常小鼠免疫功能具有調(diào)節(jié)作用;在本研究組的前期研究中，發(fā)現(xiàn)毛蚶多肽提取物(PEAS)在體外能夠顯著抑制多株腫瘤細(xì)胞的增殖[5-6]，但目前尚未見(jiàn)對(duì)PEAS免疫活性的文獻(xiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步研究PEAS的生物學(xué)活性，為其更合理的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)，本文通過(guò)考察PEAS體外對(duì)正常小鼠免疫細(xì)胞功能的影響，初步探討其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1 材料

毛蚶購(gòu)于廣州市黃沙海產(chǎn)品市場(chǎng)，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院于榮敏教授鑒定為毛蚶。新鮮毛蚶去殼，經(jīng)勻漿、離心、透析、凍干后制得PEAS，經(jīng)Lowry法檢測(cè)其蛋白含量為76.3%。

小鼠淋巴瘤細(xì)胞株YAC-1購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心子細(xì)胞庫(kù)。

RPMI 1640培養(yǎng)液，美國(guó)Hyclone公司;鏈霉素、青霉素、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Genview公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)、細(xì)菌脂多糖(LPS)、刀豆蛋白(Con A)、碘化丙啶(PI)，美國(guó)Sigma公司;小鼠干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、雙抗夾心 ELISA 檢測(cè)試劑盒，武漢華美生物工程有限公司。

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(粵)2008-0002。普通潔凈環(huán)境下飼養(yǎng)，溫度18～24℃，動(dòng)物可以自由攝食和飲水。

680型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-RAD公司;6500TC二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)NAPCO公司;CR21G型冷凍離心機(jī)，日本日立公司;EPICSXL-MCL型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Backman-Coulter公司。

2 方法

2.1 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響

頸椎脫臼法處死小鼠，用75%酒精浸泡約3 min消毒，剪開(kāi)皮膚暴露腹膜，剪開(kāi)腹膜無(wú)菌取脾并置于無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，沖洗2次，用注射器取無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液約5 mL，輕輕插入脾內(nèi)吹出細(xì)胞，重復(fù)操作數(shù)次至脾外膜透明，余下脾臟用注射器研磨并過(guò)200目篩。收集全部細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入Tris-NH4Cl溶液約3 mL輕輕吹勻，去除紅細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)操作2次。細(xì)胞沉淀用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，輕輕吹勻，1000 r/min離心5 min，棄上清。細(xì)胞沉淀用RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞95%以上。

取脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。分為3組:PEAS單藥組、PEAS+Con A組和PEAS+LPS組。PEAS單藥組每孔分別加入含不同濃度PEAS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL，使PEAS的終濃度分別為 15.62，31.25，62.5，125，250 和 500 μg/mL，并設(shè)陰性對(duì)照組(加RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL);PEAS+Con A組每孔 PEAS終濃度同PEAS單藥組，每空另加入Con A，終濃度為5 μg/mL，并設(shè)陰性對(duì)照組(加10 μg/mL Con A的RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL);PEAS+LPS組每孔PEAS終濃度同 PEAS單藥組，每空另加入LPS，終濃度為 20 μg/mL，并設(shè)陰性對(duì)照組(加 40 μg/mL LPS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL)。各濃度組均設(shè)3復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，3000 r/min 離心 30 min，棄上清，每孔加入二甲亞砜(DMSO)200 μL，振蕩10 min至形成的紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值[7-8]。

2.2 PEAS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

參照文獻(xiàn)[9]制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.4×106個(gè)/mL，將此細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄上清。加入不同濃度的PEAS，每孔200 μL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基 200 μL)和陽(yáng)性對(duì)照組(1 μg/mL LPS 200 μL)，每組均設(shè) 6 復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄上清，用D-Hanks液200 μL/孔洗 3遍，加入 0.075% 中性紅溶液 200 μL/孔，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，棄上清，用 DHanks液 200 μL/孔洗 3遍，加入細(xì)胞裂解液(1 mol/L醋酸與等體積無(wú)水乙醇混合)200 μL/孔，微型振蕩器上振蕩3 min，37℃孵育1 h。測(cè)定其在570 nm波長(zhǎng)處A值，吞噬中性紅增加率(%)=(A給藥－A對(duì)照)/A對(duì)照×100%。

2.3 PEAS對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

效應(yīng)細(xì)胞制備:常規(guī)制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)＞95%)，完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL，按1 mL/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再加入高、中、低(500，100，20 μg/mL)濃度的PEAS溶液1 mL，并設(shè)置陰性對(duì)照(培養(yǎng)基1 mL)和陽(yáng)性對(duì)照(Con A，終濃度為5 μg/mL)。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，培養(yǎng)液洗3遍后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。

靶細(xì)胞的制備:取YAC-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)＞95%)。調(diào)整效靶比(E∶T)為50∶1，接種于 96 孔板，實(shí)驗(yàn)孔效、靶細(xì)胞各 100 μL，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加效應(yīng)細(xì)胞、培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞對(duì)照孔加靶細(xì)胞、培養(yǎng)液各100 μL，每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于各孔中加入5 mg/mL MTT溶液20 μL共同培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，3000 r/min離心30 min，棄上清，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min至形成的紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，結(jié)果以NK細(xì)胞活性表示。NK細(xì)胞活性(%)=[1 － (A實(shí)驗(yàn)孔(效+靶)－ A效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔)/A靶細(xì)胞對(duì)照孔]×100%[7，10]。

2.4 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響

取小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，每孔分別加入含不同濃度PEAS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液1 mL，使 PEAS 終濃度分別為 20，100，500 μg/mL，并設(shè)陽(yáng)性和陰性(終濃度5 μg/mL Con A和等體積細(xì)胞培養(yǎng)液)對(duì)照孔，每孔溶液終體積為2 mL，每組均設(shè)3復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。1500 r/min離心15 min，棄去培養(yǎng)液，70%預(yù)冷乙醇重懸，混勻，置于4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞1500 r/min離心10 min，棄去液體，各管加PI染液(PI 2.5 mg，RNase 5 mg，Triton X-10015 μL 溶于 PBS 50 mL中，過(guò)濾，4℃避光保存)200 μL，混勻后避光放置20 min，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算脾淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞百分率[11]。

2.5 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

取小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，每孔分別加入含不同濃度PEAS和含5 μg/mL Con A的混合液1 mL，PEAS 終濃度分別為 20，100，500 μg/mL，并設(shè)陰性對(duì)照孔(終濃度5 μg/mL Con A)，每孔溶液終體積為2 mL，每組均設(shè)3復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48和72 h后，4℃，2000 r/min 離心10 min，收集上清，用于測(cè)定 IFN-γ、IL-4。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用的影響

由圖1可見(jiàn)，PEAS單藥組在各個(gè)濃度作用下對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率均有顯著增強(qiáng)作用(P＜0.01)，濃度在 125 μg/mL 以下具有量效關(guān)系，濃度大于125 μg/mL時(shí)，增殖率下降;PEAS協(xié)同LPS刺激B細(xì)胞，在濃度高于31.25 μg/mL時(shí)對(duì)B細(xì)胞的增殖具有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01);PEAS協(xié)同Con A刺激T細(xì)胞，在濃度高于62.5 μg/mL時(shí)有顯著增強(qiáng)作用(P＜0.05或0.01)，具有明顯量效關(guān)系，且其對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用強(qiáng)于B淋巴細(xì)胞。

圖1 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響(，n=3)Fig.1 Effects of PEAS on the splenic lymphocytes proliferation in the mice(，n=3)

3.2 PEAS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

如表1所示，PEAS在濃度為 15.62 μg/mL時(shí)作用不顯著(P ＞0.05)，在濃度為 31.25 μg/mL 及以上時(shí)，能顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅(P＜0.01)，且呈量效關(guān)系。此結(jié)果表明，PEAS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力有一定的促進(jìn)作用。

表1 PEAS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅功能的影響(，n=6)Tab.1 Effect of PEAS on phagocytosis of mouse peritoneal macrophagocyte(，n=6)

表1 PEAS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅功能的影響(，n=6)Tab.1 Effect of PEAS on phagocytosis of mouse peritoneal macrophagocyte(，n=6)

與對(duì)照組比較:1P＜0.01 1P ＜0.01 vs control group

組 別 劑量/(μg/mL) A570 增加率/%對(duì)照組 －0.374 ±0.036 －PEAS 組 15.62 0.407 ±0.020 8.7131.25 0.473 ±0.0311 26.4662.50 0.474 ±0.0321 26.55125.00 0.548 ±0.0281 46.31250.00 0.543 ±0.0401 45.06500.00 0.564 ±0.0271 50.711000.00 0.576 ±0.0211 53.69 LPS 組 1.00 0.602 ±0.024160.71

3.3 PEAS對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響

從表2可見(jiàn)，PEAS在低濃度(20 μg/mL)對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性有促進(jìn)作用，但不顯著(P＞0.05);在中、高濃度下對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性有顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05)，且在總體水平上隨著PEAS濃度的升高而增強(qiáng)。

表2 PEAS對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響(，n=4)Tab.2 Effects of PEAS on NK cell cytoactive of mice in vitro(，n=4)

表2 PEAS對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響(，n=4)Tab.2 Effects of PEAS on NK cell cytoactive of mice in vitro(，n=4)

與對(duì)照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01 1P ＜0.05，2P ＜0.01 vs control group

組 別 劑量/(μg/mL) A570 NK活性/%對(duì)照組0 0.246 ±0.039 16.75 PEAS 組 20 0.230 ±0.025 22.25100 0.215 ±0.0451 27.24500 0.186 ±0.0341 37.05 Con A 組 5 0.161 ±0.013245.60

3.4 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響

與正常對(duì)照組相比，PEAS在高、中、低三個(gè)劑量(500，100，20 μg/mL)作用24 h 后，均能增加小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)入S期細(xì)胞的百分率，且差異極顯著(P ＜0.01)。PEAS 在高劑量(500 μg/mL)時(shí)效果最明顯，其S期的比值增加了18.9%，見(jiàn)表3。

表3 PEAS對(duì)脾細(xì)胞周期分布的影響(，n=3)Tab.3 Effects of PEAS on the cell cycle of splenic lymphocytes of mice(，n=3)

表3 PEAS對(duì)脾細(xì)胞周期分布的影響(，n=3)Tab.3 Effects of PEAS on the cell cycle of splenic lymphocytes of mice(，n=3)

與對(duì)照組比較:1P＜0.01 1P ＜0.01 vs control group

劑量(G1/G0)S/% (G2/M)組 別 /(μg/mL)/% /%對(duì)照組0 76.7 ±0.82 20.7 ±0.32 1.8 ±0.12 PEAS 組 20 67.4 ±0.59 28.5 ±0.8311.8 ±0.32100 63.6 ±0.53 33.6 ±0.3312.0 ±0.41500 57.9 ±0.78 39.6 ±0.5811.9 ±0.37 Con A 組 5 49.7 ±0.61 46.7 ±0.7512.8 ±0.26

3.5 PEAS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

由表4可見(jiàn)，當(dāng)PEAS協(xié)同Con A與細(xì)胞作用24 h后，TH1細(xì)胞因子IFN-γ的分泌量并沒(méi)有顯著的變化(P＞0.05)，在各濃度作用48或72 h后，IFN-γ的分泌量均增加(P ＜0.05或0.01)，并且在作用48 h后呈現(xiàn)出比較明顯的量效關(guān)系;當(dāng)PEAS協(xié)同ConA與細(xì)胞作用24，48或72 h后，在中、高濃度(100，500 μg/mL)作用下，TH2 細(xì)胞因子 IL-4 的分泌量顯著減少(P＜0.05或0.01)。

表4 PEAS對(duì)脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響(，n=3)Tab.4 PEAS regulated cell production of IFN-γ and IL-4(，n=3)

表4 PEAS對(duì)脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響(，n=3)Tab.4 PEAS regulated cell production of IFN-γ and IL-4(，n=3)

與對(duì)照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01 1P ＜0.05，2P ＜0.01 vs control group

劑量24 h48 h72 h組 別 /IFN-γIL-4IFN-γIL-4IFN-γIL-4(μg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)/(pg/mL)對(duì)照組 0 66.67 ±16.33 46.15 ±5.03 170.21 ±25.54 63.23±6.12 87.43 ±21.31 61.33 ±8.11 PEAS 組 20 53.33 ±7.33 55.49 ±8.22 233.33 ±33.351 58.35 ±4.45 153.36 ±21.561 46.39 ±5.14100 74.57 ±18.46 32.33 ±5.151 323.38 ±42.332 60.67 ±6.05 230.65 ±32.782 36.33 ±4.762 500 60.23 ±8.23 29.67 ±7.122 416.67 ±42.232 39.67 ±4.212146.82 ±24.671 41.32 ±5.341

4 討論

淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)是機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的前提，淋巴細(xì)胞的增殖反映了機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫的功能[9]。本實(shí)驗(yàn)選取了脾臟作為制取淋巴細(xì)胞的器官，通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明PEAS可促進(jìn)未活化的淋巴細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)經(jīng)Con A或LPS活化的T或B淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05或0.01)。此結(jié)果提示PEAS可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的增殖活性，且其本身具有有絲分裂原樣作用。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)的專職性抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體主要的免疫活性細(xì)胞之一。未活化的巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷作用是有限的，巨噬細(xì)胞被激活后，其吞噬作用會(huì)增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中，采用中性紅吞噬法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEAS在濃度為31.25 μg/mL時(shí)，即可顯著促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中功能(P＜0.01)，并且其吞噬功能在總體水平上隨著PEAS濃度的升高而增強(qiáng)。此外，NK細(xì)胞為機(jī)體重要的免疫監(jiān)視細(xì)胞，能非特異性的殺傷各種腫瘤細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)中利用對(duì)NK敏感的YAC-1細(xì)胞株作為靶細(xì)胞測(cè)定NK殺傷活性，結(jié)果表明PEAS能顯著促進(jìn)小鼠NK細(xì)胞活性(P＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，PEAS能夠活化腹腔巨噬細(xì)胞及NK細(xì)胞，提示其對(duì)機(jī)體的非特異性免疫功能具有一定的促進(jìn)作用。

本文還采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，觀察了PEAS對(duì)脾淋巴細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，PEAS能夠顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞由G0/G1期向DNA合成期即S期轉(zhuǎn)化(P＜0.01)，證明PEAS通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞 DNA合成，而起到促淋巴細(xì)胞增殖的作用。

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEAS能夠顯著增加Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的分泌，并且降低Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌(P＜0.05或0.01)。說(shuō)明PEAS有潛力應(yīng)用于治療由于Th2細(xì)胞因子分泌過(guò)多而導(dǎo)致的免疫疾病，促使Th細(xì)胞向Th2方向偏移的逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到治療免疫性疾病的目的。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了PEAS對(duì)小鼠的免疫功能具有一定的正向調(diào)節(jié)作用，為其作用機(jī)制的闡明奠定了基礎(chǔ)。

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