大鯢皮膚分泌液中抗菌肽的鑒定及生物活性研究

王利鋒，李學(xué)英，王大忠，2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563003;2.銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

兩棲類皮膚濕潤、裸露，無疑給外界微生物的侵入提供了便利條件，為了自身生存和適應(yīng)棲息地多樣化生態(tài)環(huán)境的需要，它們依靠皮膚腺體分泌出一系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵襲[1]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，兩棲類皮膚抗菌肽呈現(xiàn)出超乎想象的分子和功能的多樣性[2-3]。國內(nèi)外對(duì)于兩棲類皮膚抗菌肽的研究主要集中在無尾目兩棲類，例如最廣泛分布的蛙科(Ranidae)，它們皮膚抗菌肽在種類和數(shù)量等方面，都是極其驚人的[4]。而對(duì)于有尾目兩棲類，除紅瘰疣螈[5](Tylototriton verrucosus)和山溪鯢[6](Batrachuperus)外，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道其皮膚分泌液存在抗菌活性物質(zhì)。

大鯢(Megalobatrachus japonicus daridianus Blanchard)屬大型兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，是我國二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，有活化石之稱。人們?cè)跉W洲、東亞和北美地區(qū)發(fā)現(xiàn)的大約距今300萬至7000萬年的大鯢化石暗示其在地球上曾廣泛分布[7]。

目前我國大鯢的人工養(yǎng)殖已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，為從大鯢皮膚分泌液中提取抗菌肽提供了豐富的資源。作為現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲類動(dòng)物，其皮膚腺發(fā)達(dá)，在試驗(yàn)中觀察到大鯢皮膚在受到理化刺激時(shí)能分泌大量白色狀黏液，最初呈白漿狀，后漸變?yōu)轲こ砟z狀物，具濃澀氣味。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鯢皮膚分泌液中是否含有抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行了檢測，并鑒定其部分性質(zhì)，為進(jìn)一步的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物和菌種

成年大鯢雌雄各一尾，購于貴州錦江娃娃魚有限公司。

菌種:大腸埃希菌(Escherichia coli)No.ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)No.ATCC 29213、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)No.ATCC 35984、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)No.ATCC 27853、白色念珠菌(canidia Albicans)No.ATCC 10213、溶血性鏈球菌(Hemolytic streptococcus)No.CMCC(B)32264，遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室保藏。

1.2 試劑

葡聚糖凝膠SephadexG-50和SephadexG-25，GE Healthcare公司;低相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)標(biāo)準(zhǔn)蛋白，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司;TEMED、Tris、Tricine、丙烯酰胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R-250，美國Sigma公司;BCA法蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MH(A)培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 皮膚分泌液的粗提

采用電刺激法誘導(dǎo)大鯢皮膚分泌黏液。按體積比1∶1將收集到的皮膚分泌液用5%乙酸浸提，4℃下攪拌24 h。12000 r/min離心30 min取上清，用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至7.2，12000 r/min離心30 min，取上清冷凍干燥，

2.2 抗菌肽分離純化

粗提物用注射用水溶解，截留Mr10000的超濾膜4℃下超濾分離，收集Mr大于10000和小于10000兩部分溶液，抑菌圈法[7]篩選有抗菌活性的溶液，經(jīng) 0.45 μm 膜過濾后，Sephadex G-50 凝膠色譜(1.6 cm ×60 cm)分離，用0.05 mol/L 的Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)平衡色譜柱，樣品上樣后用同樣的緩沖液洗脫，流速為2.0 mL/8 min，每8 min收集1管，測定A280nm，繪制洗脫曲線，收集各峰。同樣方法篩選具有較強(qiáng)抗菌活性的峰，冷凍干燥濃縮樣品至4.5 mL，再采用相同方法，進(jìn)行Sephadex G-25凝膠色譜(1.6 cm×60 cm)分離，得到具有抗菌活性的溶液濃縮后4℃保存。

2.3 蛋白質(zhì)含量檢測

BCA法蛋白定量試劑盒檢測抗菌肽溶液的蛋白質(zhì)含量，按試劑盒說明書操作。

2.4 電泳鑒定

2.4.1 Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳 分離膠、夾層膠、濃縮膠分別為16.5%，10%和4%的丙烯酰胺凝膠，厚度為0.75 mm，3 種膠長度比例為 4∶1.5∶1，陽極緩沖液為0.2 mol/L Tris緩沖液(pH 8.9)，陰極緩沖液為 0.1 mol/L Tris(內(nèi)含 0.1 mol/L Tricine，0.1%SDS，pH 8.25)溶液。每孔上樣量 15 μL，30 V恒壓電泳約30 min，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至100 V約3 h。

2.4.2 等電聚焦電泳 按《中國藥典》三部(2005版)方法進(jìn)行，不同之處在于配制凝膠時(shí)加入尿素，使最終的電泳膠含33%的尿素。

2.5 抗菌活性檢測

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)基為MH(A)培養(yǎng)基;溶血性鏈球菌的培養(yǎng)基為在MH(A)培養(yǎng)基中加入10%的脫纖維羊血;白色念珠菌培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(SDA)。采用抑菌圈法，中央孔加入注射用水作為陰性對(duì)照，其中一孔加入相應(yīng)抗生素為陽性對(duì)照，37℃恒溫培養(yǎng)18 h(白色念珠菌28℃恒溫培養(yǎng)2 d)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10 mm作為樣品最小抑菌濃度的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 溶血活性檢測

微量溶血試驗(yàn)評(píng)估溶血活性。取健康人血液用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞至上清無色，3000 r/min離心1～2 min，棄上清，用生理鹽水配成2%紅細(xì)胞懸液，將抗菌肽溶液用生理鹽水稀釋成500，100，50，40，30，20，10 μg/mL 的溶液，加入等體積的 2% 紅細(xì)胞懸液，陽性對(duì)照為0.1%TritonX-100，陰性對(duì)照為生理鹽水，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔，37℃孵育1 h，離心去掉完整的紅細(xì)胞。取上清，540 nm波長處測定各管的吸光度值。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.7.1 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 100 μg/mL抗菌肽溶液分別在 40，50，60，70，80，90，100，121 ℃ 下處理 10 min，冰浴冷卻，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試驗(yàn)菌，未處理抗菌肽溶液為對(duì)照，測定其抑菌圈直徑，每個(gè)處理樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小確定其熱穩(wěn)定性。

2.7.2 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 100 μg/mL抗菌肽溶液用0.1 mol/L HCl溶液或 0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)整樣品pH 2.5～10.0;室溫放置2 h，用磷酸鹽緩沖液將樣品pH值復(fù)調(diào)至7.2，未經(jīng)處理的抗菌肽溶液為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為試驗(yàn)菌，每個(gè)處理樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，根據(jù)抑菌圈直徑大小確定其酸堿穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 大鯢皮膚分泌物中抗菌肽的分離純化

超濾液抗菌活性檢測，Mr小于10000的溶液具有明顯的抗菌活性。

Sephadex G-50柱色譜分離，得到2個(gè)明顯的主峰(圖1)。抗菌試驗(yàn)表明，第2個(gè)主峰36～89管收集液有明顯的抗菌活性。Sephadex G-25柱色譜分離，得到3個(gè)明顯的峰(圖2)?？咕囼?yàn)表明，第2個(gè)峰11～40管收集液有明顯的抗菌活性。

圖1 Sephadex G-50凝膠過濾色譜結(jié)果Fig.1 The result of gel chromatography by Sephadex G-50

圖2 Sephadex G-25凝膠過濾色譜結(jié)果Fig.2 The result of gel chromatography by Sephadex G-25

3.2 蛋白質(zhì)含量檢測

線性回歸方程為:A=0.344 C+0.145，r=0.997，根據(jù)回歸方程計(jì)算出抗菌肽溶液蛋白質(zhì)含量為 0.95 mg/mL。

3.3 電泳鑒定結(jié)果

經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定大鯢皮膚分泌液的粗提物中蛋白條帶多，Sephadex G-50分離后有3條蛋白條帶，Sephadex G-25分離后呈單一蛋白條帶，其Mr約為4300(圖3);Sephadex G-25分離后的樣品經(jīng)等電聚焦電泳鑒定蛋白條帶存在于pH梯度(pH 3～10)電泳中的偏堿性區(qū)域，表現(xiàn)出較強(qiáng)的陽離子特征。

圖3 Tricine-SDS-PAGE電泳Fig.3 Electrophoresis in Tricine-SDS-PAGE

3.4 抗菌活性檢測

抗菌肽溶液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌和白色念珠菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，最小有效抑菌濃度分別為12，16，16，22，16，18 μg/mL。

3.5 溶血性檢測

血平板檢測結(jié)果未見溶血現(xiàn)象。說明不同濃度的大鯢皮膚分泌液中抗菌肽溶液對(duì)人血紅細(xì)胞沒有溶血作用。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.6.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見圖4。大鯢皮膚分泌液中抗菌肽對(duì)溫度有較好的耐受性，樣品在20～40℃抗菌活性沒有變化，100℃煮沸10 min還有抗菌活性，121℃保持10 min后無抗菌活性。

圖4 不同溫度處理后的抗菌肽抗菌活性Fig.4 Effect of the extracts from the skin secretions of the Andrias davidianus at different temperature against staphylococcus aureus

3.6.2 酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見圖5。大鯢皮膚分泌物中抗菌肽在pH 5.0～8.0時(shí)抗菌活性穩(wěn)定，在pH 3.0以下，pH 9.0以上活性喪失。

圖5 不同pH處理后抗菌肽的抗菌活性Fig.5 Effect of acid and alkali on antagonistic impact of the extracts from the skin secretions of the Andrias davidianus

4 討論

兩棲類皮膚抗菌肽是先天性防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有高效、廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[8-9]，在耐抗生素病原菌株大量涌現(xiàn)的今天，這類皮膚抗菌肽有望成為新一代的臨床抗菌藥物[10]。

本研究首次從大鯢皮膚分泌液中分離純化出一種具有抗菌活性的小分子多肽。研究結(jié)果表明，大鯢皮膚分泌液中含有抗菌活性物質(zhì)，這種抗菌活性物質(zhì)對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和真菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性，并且隨著濃度的升高其抗菌活性增強(qiáng);同時(shí)它還具有較強(qiáng)的耐高溫的特性，對(duì)較高或較低的pH均具有較強(qiáng)的耐受性，在pH 5.0～8.0的時(shí)候抗菌效果最為明顯;不同濃度的溶液對(duì)人血紅細(xì)胞沒有溶血作用;Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜可見單一的條帶，其Mr約為4300，等點(diǎn)聚焦電泳檢測顯示該小分子多肽具有較強(qiáng)的堿性，此抗菌肽也可能是一個(gè)具有較強(qiáng)陽離子特征的堿性肽。這與近年報(bào)道的兩棲類動(dòng)物皮膚分泌物中抗菌肽相似。因此，本研究結(jié)果提示從大鯢皮膚分泌物中得到的抗菌活性成分是一種抗菌肽。

抗菌肽的抗菌機(jī)制目前公認(rèn)的是抗菌肽與細(xì)胞膜的作用，是通過分子聚集在細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外形成離子通道，導(dǎo)致膜去極化，使得細(xì)胞膜不能維持正常的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物大量外流，最后細(xì)胞停止生長或發(fā)生死亡，即所謂通道理論[11]。正電荷在這種抗菌機(jī)制中起到了關(guān)鍵作用，這些陽離子抗菌肽通過與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷之間的靜電吸引而結(jié)合在質(zhì)膜上。然后抗菌肽分子的疏水端借助水分子中連接結(jié)構(gòu)的柔性，插入質(zhì)膜中，這樣就打亂了質(zhì)膜上蛋白質(zhì)和脂質(zhì)原有的排列秩序，最終通過膜內(nèi)分子間的相互移位，使抗菌肽分子相互聚集在一起，形成離子性通道，導(dǎo)致細(xì)菌失去膜勢，不能保持正常的滲透壓而死亡[12]。Issacson 等[9]發(fā)現(xiàn)蛙皮抗菌肽Temporin-1Ja(ILPLVGNLLNDLL-NH2)幾乎不表現(xiàn)抗菌活性，與Temporin-1族其它抗菌肽分子對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Temporin-1Ja由于第11位的賴氨酸殘基被天冬氨酸殘基取代成為陰離子肽。Lai等[13]發(fā)現(xiàn)從大蹼鈴蟾cDNA庫中篩選到的陰離子抗菌肽maximin H5(ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2)僅具備有限的抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)從大鯢皮膚分泌液中得到的抗菌肽，通過等點(diǎn)聚焦電泳檢測顯示出較強(qiáng)的陽離子特征，該小分子肽也是一個(gè)堿性肽，我們推測其抗菌機(jī)制也可能是通過細(xì)胞膜而發(fā)揮作用的。

目前，雖然從大鯢皮膚分泌液中純化得到了一種抗菌肽，但仍有許多問題需要闡明，如大鯢皮膚分泌物中是否還存在其它一些活性肽(廣譜性的和抗細(xì)菌的)以及它們的結(jié)構(gòu)和功能等方面都需要做進(jìn)一步研究，以獲得將大鯢皮膚分泌液中抗菌肽開發(fā)為新一代抗感染藥物所必須了解的信息。

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