抗CD5單鏈抗體的基因構(gòu)建、蛋白純化及活性鑒定

林曉思，許 健，王生育，顏江華

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心，福建 廈門 361000)

雙特異抗體可以有效的將效應(yīng)細(xì)胞富集到靶細(xì)胞周圍，增強(qiáng)對靶細(xì)胞的殺傷，因而雙特異抗體介導(dǎo)的免疫細(xì)胞治療是一種很有前景的腫瘤治療手段。CD5是一種泛T細(xì)胞(pan T Cell)表面標(biāo)記，在雙特異性抗體介導(dǎo)T細(xì)胞對腫瘤靶向治療的過程中，CD5可以取代CD3和FcR作為雙特異抗體在T細(xì)胞表面的結(jié)合點(diǎn)，并消除這兩者和配體交聯(lián)后引發(fā)的副作用[1-2]。另一方面在 T淋巴細(xì)胞瘤中由于CD5的表達(dá)上調(diào)，因此CD5也被選作治療靶點(diǎn)[3-4]。本文擬采用基因工程手段，構(gòu)建 scFv anti-CD5/pET22b(+)重組質(zhì)粒，原核表達(dá)重組蛋白。為構(gòu)建以scFv anti-CD5為構(gòu)件的雙特異抗體以及免疫偶聯(lián)物提供物質(zhì)前提，并為其應(yīng)用于腫瘤的免疫治療提供基礎(chǔ)。

1 材料

菌種 E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α 和質(zhì)粒pET22 b(+)，Novagen 公司;細(xì)胞株 EC304，南京凱基生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，長春藤生物技術(shù)有限公司;Pfu DNA聚合酶，天根生物技術(shù)有限公司;NcoⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶、T4DNA連接酶，NEB公司;Ni-NTA agarose，GE公司;HRP標(biāo)記抗His-tag兔多克隆抗體，北京康維世紀(jì)生物技術(shù)有限公司;異硫氰酸酯熒光素(FITC)，Amresco公司。引物由上海生工合成。

EPICS XL流式細(xì)胞儀，美國 Beckman-Coulter公司。

2 方法

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 基因序列與引物設(shè)計(jì) 從NCBI Genbank里查到DNA序列M90468和M90467，扣除前面66 bp的pelB信號肽序列后得到的即是anti-CD5的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL的序列。在VH和VL之間插入linker-(G4S)3編碼序列，在VH的5'添加NcoⅠ酶切位點(diǎn)，在VL的3'端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)，并在整個基因兩端添加保護(hù)堿基序列，并通過E.coli高頻率簡并密碼子取代原始序列中的稀有密碼子，設(shè)計(jì)出的目的基因scFv anti-CD5序列(共計(jì)741 bp)，合成10條拼接引物F1-R10，以及一對擴(kuò)增引物 F11和 R11(表1)。

2.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將F1-R10等10條拼接引物，溫育獲得基因scFv anti-CD5，溫育反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，68℃溫育2 h;72℃延伸10 min。加入F11和R11擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min;33個循環(huán)后，72℃延伸10 min，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定后以NcoⅠ和XhoⅠ酶切PCR產(chǎn)物，回收和純化酶切產(chǎn)物，在T4連接酶的作用下將其插入到經(jīng)同種酶切的pET22b(+)中，獲得重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌液PCR篩選，選擇PCR反應(yīng)產(chǎn)物和理論設(shè)計(jì)值大小一致的克隆送上海Invitrogen公司測序。

2.2 重組蛋白在E.coli中的表達(dá)、純化與復(fù)性

將測序正確的重組質(zhì)粒scFv anti-CD5/pET22 b(+)轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21(DE3)，挑取單菌落，接種到含終濃度50 μg/mL氨芐西林(Amp)的LB培養(yǎng)液3 mL中，37℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;再按1∶100稀釋至含終濃度50 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液300 mL 中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至 A600為0.6 ～0.8;加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1 mmol/L，37℃，250 r/min誘導(dǎo)6 h。包涵體溶解后的上清液，用鎳親和色譜柱純化，操作過程參照GE公司提供的操作指南進(jìn)行。純化后的蛋白對含1%PEG4000、0.4 mol/L 精氨酸的100 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.7)透析復(fù)性。

2.3 scFv anti-CD5的 FITC 標(biāo)記

對0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液透析后的scFv anti-CD5，濃縮到 1 mL(約 200 μg/mL)，往其中加入1 mg/mL FITC溶液12 μL，置4℃反應(yīng)4 h，用超濾管4℃離心重懸數(shù)次以去除游離的熒光素，測得A280=0.084，A495=0.100，將 scFv anti-CD5-FITC 均分 4份，將最后一次離心得到的穿出液吸出1 mL，平均分為4份。整個過程注意避光。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測scFv anti-CD5的活性

收獲對數(shù)生長期的細(xì)胞，冰冷的PBS(pH 7.4)洗滌2次;4%多聚甲醛溶液重懸并室溫固定30 min以上，冰冷的PBS(pH 7.4)復(fù)洗2次;血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整各種細(xì)胞濃度至2.5×105，取細(xì)胞1 mL，離心后用細(xì)胞封閉液封閉2 h，用冰冷的PBS洗2遍，然后加入等量的scFv anti-CD5-FITC，4℃避光反應(yīng)12 h，冰冷的PBS(pH 7.4)洗去未結(jié)合蛋白 (每步離心條件均為:4℃，1200 r/min，6 min);洗滌5次，加入PBS至1 mL，300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。

2.5 細(xì)胞膜蛋白提取

分別收集EC304、CIK細(xì)胞后，冰浴超聲破碎，9000 r/min離心10 min，去除未破裂的細(xì)胞和細(xì)胞核碎片，然后取上清，加入適量體積的solution B，43000 r/min超速離心1 h，即得到細(xì)胞的總膜蛋白粗提物。

2.6 Western blotting

取細(xì)胞總膜蛋白10 μg上樣，10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE電泳，100 mA電流半干轉(zhuǎn)2 h;2%BSA室溫封閉2 h，傾去封閉液，將硝酸纖維素膜放入干凈的培養(yǎng)皿中，分別加封閉液稀釋的scFv anti-CD5，scFv anti-CD5約為 5 μg/mL，4 ℃過夜;TBST洗3次，每次5～10 min，加入1∶1000稀釋的 HRP標(biāo)記抗His-tag兔多克隆抗體，室溫放置1.5 h;TBST洗3次，每次5～10 min;DAB顯色。

3 結(jié)果

3.1 重疊PCR構(gòu)建scFv anti-CD5

將F1-R10等10條拼接引物，溫育獲得含基因scFv anti-CD5的混合物，以此為模板，用F11和R11為引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增出scFv anti-CD5基因。如圖1所示，在泳道2中從100～800 bp之間的彌散狀條帶為重疊PCR的產(chǎn)物，泳道1為F11和R11擴(kuò)增拼接產(chǎn)物后得到了兩條帶，其中一條在740 bp左右，可能是目的基因。純化產(chǎn)物位于740 bp左右，與理論設(shè)計(jì)值一致。

表1 引物序列Fig.1 Sequence of primers

圖1 scFv anti-CD5基因的構(gòu)建Fig.1 Gene construction of scFv anti-CD5

3.2 scFv anti-CD5重組子的復(fù)篩

基因和載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取3個單菌落，以F11和R11為上下游引物進(jìn)行PCR復(fù)篩鑒定，1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示在700～800 bp處均有一特異性亮帶(圖2)，與理論設(shè)計(jì)值相符，測序結(jié)果進(jìn)一步證明2號和3號菌落含有序列正確的重組質(zhì)粒scFv anti-CD5/pET22b(+)的克隆(測序結(jié)果略)。

圖2 scFv anti-CD5重組子篩選PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Analysis of PCR product of scFv anti-CD5 recombinant using primers F11 and R11

3.3 融合蛋白scFv anti-CD5在 E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)

誘導(dǎo)scFv anti-CD5表達(dá)后，將菌體裂解，分別收集超聲上清、沉淀進(jìn)行電泳，經(jīng)過染色、脫色，結(jié)果如圖3所示。在相對分子質(zhì)量(Mr)約28000處有一明顯的表達(dá)帶，而未誘導(dǎo)菌沒有出現(xiàn)相同的條帶，同時觀察到目的蛋白絕大部分存在于超聲沉淀中，說明融合蛋白在宿主菌中主要以包涵體的形式存在。包涵體處理后，過鎳親和柱純化，電泳后幾乎只出現(xiàn)1條蛋白質(zhì)條帶，說明經(jīng)親和色譜純化到較高的純度。

圖3 蛋白表達(dá)形式以及純化Fig.3 Protein expression analysis and purification.

3.4 流式細(xì)胞儀檢測scFv anti-CD5的活性

CD5僅在T淋巴細(xì)胞及其分化亞群高表達(dá)，CIK細(xì)胞是T細(xì)胞在體外由anti-CD3和IL2誘導(dǎo)分化得到的CD5陽性細(xì)胞株[2]。將scFv anti-CD5標(biāo)記上FITC后，用流式細(xì)胞儀檢測scFv anti-CD5結(jié)合CD5的能力。結(jié)果如圖4所示，EC304組和CIK組的平均熒光強(qiáng)度分別為1.19和6.83;可見scFv anti-CD5-FITC特異的結(jié)合到了CIK上。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測scFv anti-CD5活性Fig.4 Flow cytometry for cell labeled with scFv anti-CD5-FITC

3.5 scFv anti-CD5結(jié)合CD5能力的驗(yàn)證

采用Western blotting的方法進(jìn)一步分析scFv anti-CD5是否特異的結(jié)合到CD5分子上。結(jié)果如圖5所示，在Mr約67000有條帶，這個位置與文獻(xiàn)報(bào)道的CD5的位置相符[5]，說明得到的 scFv anti-CD5能夠識別CD5抗原。

4 討論

圖5 Western blotting分析scFv anti-CD5的抗原結(jié)合特異性Fig.5 Western blotting analysis of antigenic specificity of scFv anti-CD5

本研究成功地構(gòu)建了scFvanti-CD5/pET22b(+)重組質(zhì)粒，表達(dá)的蛋白純化復(fù)性后能夠特異的識別CD5抗原。目前常用的CD5抗體多為鼠源性的完整抗體。這些抗體人體內(nèi)反復(fù)使用可引起人體產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng);完整的抗體Mr大，不易穿透各種屏障;而且它們的Fc段的存在可使其與體內(nèi)具有Fc受體的非特異組織細(xì)胞結(jié)合，影響其靶向效果。完整抗體的這3個缺點(diǎn)使之在臨床的應(yīng)用方面大大受到限制，而且用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)完整抗體(mAb或bsAb)的成本比較高，不利于大量的制備。反觀單鏈抗體，其免疫原性低、組織穿透能力強(qiáng)，不具有Fc片段，而且可以在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)，克服了完整抗體的4大缺陷，因此本研究結(jié)果有著重要的意義。然而，由于單鏈抗體只有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此其結(jié)合抗原的能力較弱。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting的結(jié)果信號都不是很強(qiáng)。通過化學(xué)交聯(lián)或?qū)捂溈贵w進(jìn)行多聚化改造，可望增強(qiáng)其親和力。

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