中華眼鏡蛇毒活性組分誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機制

劉新艷，余清聲，王桂平，余紅娥，朱 柳，袁 牧，樓曉華，騰脈坤

(1.廣州醫(yī)學(xué)院藥物研究中心，廣東 廣州 510182;2.廣州醫(yī)學(xué)院 護理學(xué)院，廣東 廣州 510182;3.廣東藥學(xué)院 中山校區(qū)，廣東 中山 528458;4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)院，安徽 合肥 230026)

血管生成(angiogenesis)是指從已存在的血管周圍發(fā)展出新的毛細(xì)血管的過程，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血管的主要成分，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進內(nèi)皮細(xì)胞存活被認(rèn)為是血管生成過程中的基本機制，越來越多有關(guān)血管生成抑制劑的研究證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可以促使腫瘤血管的退化，抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[2]。本課題組從中華眼鏡蛇毒中分離提純出一種相對分子質(zhì)量(Mr)約為8000，等電點為7.5的單一活性組分，命名為中華眼鏡蛇毒活性組分(China cobra venom active factor，CCVAF)。前期研究已經(jīng)證實CCVAF能夠選擇性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[3]，抑制肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移[4]，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[5]以及同時具有在體外抑制血管生成的作用[6]，為進一步探討其產(chǎn)生這種作用的機制，本文研究了CCVAF作用后牛肺主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(bovine arteria pulmonalis vascular endothelial cells，BAVEC)Bcl-2、caspase3 等相關(guān)蛋白的表達，探討了CCVAF誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及抑制血管生成的可能機制。

1 材料和方法

1.1 CCVAF的制備及活性鑒定

中華眼鏡蛇毒原毒通過CM-Sepharose、Protein-PakTM SP柱后得到單一組分CCVAF，CCVAF的純度應(yīng)用SDS-PAGE測定，在濃縮電壓為80 V，分離電壓為120 V的條件下，經(jīng)5%的濃縮膠，15%的分離膠，用考馬斯亮藍染色，證實其為單一條帶，Mr為8000。pH試紙法測定等電點7.5，溶血實驗結(jié)果表明沒加卵磷脂和加卵磷脂都不存在溶血活性，表明CCVAF不存在直接和間接溶血活性(此部分實驗由中國科技大學(xué)生命科學(xué)院完成)。急性毒性實驗證實其 LD50是 2.9 μg/g[5]。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640、胰蛋白酶(美國Gibco公司);胎牛血清(BCA)(杭州四季青生物工程材料有限公司);Bcl-2-FITC抗體(美國 BD公司);caspase3活性檢測試劑盒(美國Chemicon公司);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國Pierce公司)。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Quene公司);SM-3型自動酶標(biāo)儀(北京圣健東方醫(yī)療儀器廠);Ultrospec 2100紫外/可見分光光度計(英國Biochrom公司);Sigma3k30低溫超速離心機(美國Sigma公司);Becton，Dickinson FACS Vantage流式細(xì)胞儀(美國BD公司)

1.4 BAVEC的原代培養(yǎng)及鑒定

出生1 d內(nèi)、未哺乳的新生牛(廣州奶牛研究所)放血處死后打開胸腔，無菌條件下剪開心包膜，迅速取出肺主動脈，放入冰D-hanks緩沖液(含青霉素、鏈霉素)4℃保存，4 h內(nèi)采用血管內(nèi)消化法[7]進行原代培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，免疫組化鑒定第Ⅷ因子表達。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化傳代，取2～3代生長良好的細(xì)胞供實驗用。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測CCVAF作用后BAVEC Bcl-2蛋白的表達水平

取生長良好的 BAVEC，0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整為1×105細(xì)胞/mL，種植于75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞生長至80%左右鋪滿瓶底，棄瓶內(nèi)原培養(yǎng)液，實驗組加入以培養(yǎng)基RPMI 1640配制的不同濃度的CCVAF 18 mL(終濃度為 1.25，2.5，5，10 mg/L)，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，37℃孵育4 h后，收集細(xì)胞，每樣本大約為5×106細(xì)胞/mL，進行流式細(xì)胞儀分析:每管加入1×106個細(xì)胞，加入固定液 100 μL，室溫暗處孵育15 min，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入破膜劑100 μL 及 FITC 標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)抗體(Bcl-2-FITC)5 μL和相應(yīng)的陰性對照(MouseIgG1-FITC)，4℃冰箱內(nèi)孵育20 min，1000 r/min離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)0.5 mL重懸細(xì)胞，過300目尼龍網(wǎng)成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測。重復(fù)2次。

1.6 caspase 3活性的檢測

1.25，2.5，5，10 mg/L CCVAF 分別作用于生長良好的BAVEC 4 h(37℃)，對照組不用藥物處理，只給予等體積的培養(yǎng)基，消化成細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞。每管取1×106個細(xì)胞，1500 r/min離心10 min。冷的1×細(xì)胞裂解液200 μL重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min，30000 r/min離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移到新的試管中，置于冰上，采用BCA蛋白定量試劑盒分析每樣品的蛋白濃度，向測試管內(nèi)加入對照品或測量樣本 0.1 mL，加入工作液 2.0 mL，蓋緊，37℃孵育30 min，測定在562 nm波長的吸光度(A)值，測得的A值減去空白對照品的A值，以BSA對照品濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣本的蛋白濃度。確定蛋白濃度后，終濃度一致的情況下，往各樣本加入抑制劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測405 nm波長的A值。上述實驗重復(fù)2次，取2次實驗的平均A值，進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)BAVEC的鑒定

2 h后細(xì)胞開始貼壁，48～72 h后細(xì)胞鋪滿單層，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈典型的毛玻璃、鋪路石樣排列(見圖1A)，免疫組化法檢測細(xì)胞第Ⅷ因子表達，結(jié)果細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色著色，證明是血管內(nèi)皮細(xì)胞(見圖1B)。

圖1 BAVEC的鑒定Fig.1 Identification of BAVEC

2.2 CCVAF對細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達的影響

經(jīng)CCVAF作用后，流式細(xì)胞儀測定發(fā)現(xiàn)各濃度組與對照組一樣，均未見陽性峰出現(xiàn)在M1，說明抗凋亡蛋白Bcl-2表達并未受到藥物的影響，提示CCVAF可能不經(jīng)此途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀測定BAVEC Bcl-2蛋白的表達Fig.2 The expression of Bcl-2 protein in BAVEC(flow cytometer)

2.3 比色法測定capase3活性

BCA蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.001 X+0.068(r=0.952，P ＜ 0.01)，確定終濃度為 900 mg/L。由表1可見，capase3活性在1.25 mg/L組即出現(xiàn)升高，隨濃度的增加而升高，呈劑量依賴性(r=0.929，P ＜0.05)，各濃度組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。各濃度組加入capase3活性抑制劑(Ac-DEVD-CHO)后，capase3活性明顯降低，但與對照組比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明CCVAF能夠上調(diào)capase3的活性。

3 討論

蛇毒是一類天然混合毒素，含有多種活性成分，具有影響神經(jīng)、血液等系統(tǒng)、直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、對抗腫瘤生長等作用[8]。最近有報道指出，蛇毒中同樣含有血管生成抑制劑，作用于內(nèi)皮細(xì)胞，影響腫瘤的血管生成，而且抗血管生成作用同樣可以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)[9]。但發(fā)現(xiàn)的這些物質(zhì)無論是去整合素還是基質(zhì)金屬蛋白酶均來自蝰科蛇毒，眼鏡蛇毒中是否同樣存在抑制血管生成的活性物質(zhì)未見報道。我們前期研究證實從中華眼鏡蛇毒中提取的CCVAF可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、重塑等血管生成的關(guān)鍵步驟和VEGF、bFGF等血管生成的重要促進因子的表達，誘導(dǎo)破壞血管生成、抑制腫瘤生長機制之一的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3-6]，因此，這些實驗結(jié)果揭示CCVAF可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)其潛在的、重要的抑制血管生成功能。

表1 CCVAF及caspase3活性抑制劑處理后BAVEC caspase3的活性(n=6，)Tab.1 caspase3 activity of BAVEC after CCVAF and inhibitor of caspase3 activity(Ac-DEVD-CHO)(n=6，)

表1 CCVAF及caspase3活性抑制劑處理后BAVEC caspase3的活性(n=6，)Tab.1 caspase3 activity of BAVEC after CCVAF and inhibitor of caspase3 activity(Ac-DEVD-CHO)(n=6，)

與對照組相比:1P＜0.05;與同濃度但未加抑制劑Ac-DEVDCHO組相比:2P＜0.051P ＜0.05 vs control group;2P ＜0.05 vs the same concentration but no inhibitor(Ac-DEVD-CHO)group

組 別 A值對照組0.433 ±0.097 CCVAF(1.25 mg/L) 1.651 ±0.1941 CCVAF(2.5 mg/L) 2.277 ±0.2081 CCVAF(5 mg/L) 2.497 ±0.1201 CCVAF(10 mg/L) 3.647 ±0.1821 CCVAF(1.25 mg/L)+Ac-DEVD-CHO 1.293 ±0.1911 CCVAF(2.5 mg/L)+Ac-DEVD-CHO 1.492 ±0.1781，2 CCVAF(5 mg/L)+Ac-DEVD-CHO 1.500 ±0.0871，2 CCVAF(10 mg/L)+Ac-DEVD-CHO 1.585 ±0.1041，2

近年來哺乳動物細(xì)胞凋亡機制的研究取得了較大進展，細(xì)胞凋亡的兩條主要生物學(xué)通路逐漸明確:一是從死亡受體TNFR家族起始的凋亡通路，主要通過膜連接的死亡受體來激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，執(zhí)行凋亡;二是線粒體位于中心地位的凋亡通路，起點是細(xì)胞色素C由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡[10]。兩條通路的中心環(huán)節(jié)都是caspase的級聯(lián)反應(yīng)，caspase3是這一級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。Bcl-2家族既能通過家族的抑凋亡成員阻止細(xì)胞色素C的釋放抵抗凋亡，又能通過促凋亡成員Bax誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放促進凋亡，還能影響caspase活化蛋白(如 Apaf1等)的作用[10]。因此caspase蛋白水解酶、Bcl-2蛋白家族是其中關(guān)鍵的兩個調(diào)控點。在蛇毒類血管生成抑制劑研究中，Wu等[11]檢測到去整合素Rhodostomin引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的過程，caspase3活性升高，蛇毒基質(zhì)金屬蛋白酶gaminelysin[12]也造成了同樣的結(jié)果，且 Bcl-2/Bax比例降低。本研究選用這兩項指標(biāo)來反映CCVAF是否通過此途徑引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，進一步揭示CCVAF抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用機制。流式細(xì)胞儀檢測CCVAF作用后內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達與對照組相比，并無顯著變化，表明其引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與下調(diào)Bcl-2表達可能無關(guān)。而采用比色法進行CCVAF處理后內(nèi)皮細(xì)胞caspase3活性的測定，結(jié)果caspase3的活性呈濃度依賴性的升高，加入caspase3抑制劑后，其活性雖有一定程度的降低，但與對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示CCVAF可能通過激活caspase3而誘發(fā)了一系列的級連反應(yīng)，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，這就給我們以后的研究一個啟示:在細(xì)胞凋亡的兩條主要通路中，Bcl-2主要影響線粒體所在的凋亡通路，既然實驗結(jié)果Bcl-2表達沒有出現(xiàn)顯著變化，那可能就是通過另一條通路即從死亡受體TNFR家族起始，來激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，執(zhí)行凋亡。而具體的途徑更需要以后進一步的實驗證實。

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