GST-hS100A9融合蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定

游 莉，徐蘭蘭，郭元元，鄒正渝，黎玉葉，孫雙雙，羅進(jìn)勇，周 蘭

(重慶醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

S100蛋白是一類具有EF-手型的鈣調(diào)蛋白，具有多種細(xì)胞內(nèi)外的生物學(xué)功能;S100A9為該家族成員之一，是由嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在微生物成分或細(xì)胞因子刺激時(shí)分泌的促炎性蛋白，主要與S100A8以異源二聚體的形式發(fā)揮作用[1]。作為免疫原性蛋白，其高表達(dá)于各種炎性疾病和腫瘤微環(huán)境，具有促炎癥擴(kuò)散、抗菌、抑制多種正常細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)和腫瘤細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞等)生長的活性[2];但是，目前也有研究表明，其能產(chǎn)生骨髓起源的抑制細(xì)胞(MDSCs)，從而促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸[3]。上述研究提示S100A9在人體多種疾病如炎癥、腫瘤中發(fā)揮著重要作用，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)將hS100A9基因插入原核表達(dá)載體pGST-moluc，并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，再用谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads，GS4BB)分離純化出高純度的 GST-hS100A9融合蛋白，為進(jìn)一步研究hS100A9蛋白的功能及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pGST-moluc、pHAHA-hS100A9質(zhì)粒由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室饋贈(zèng);PCR引物由Takara公司合成;高保真PCR、普通PCR、DNA連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 HindⅢ 購自Takara公司;膠回收、DNA純化試劑盒購自O(shè)mega公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自 Bio Basic Inc;預(yù)染的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)標(biāo)準(zhǔn)購自Fermertans;丙烯酰胺、還原型谷胱甘肽購自Amresco;GS4BB購自Amersharm Biosciences;hS100A9抗體購自SANTA CRUS公司;BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自Beyotime;CCK-8試劑盒購自Dojindo公司。

1.2 pGST-hS100A9質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 hS100A9基因片段的獲得 以 pHAHA-hS100A9為模板，設(shè)計(jì)含BamHⅠ/HindⅢ酶切位點(diǎn)的hS100A9片段的引物(sense/BamHⅠ:5'-CGCGGATCCGCATGACTTGCAAAATGTCGCAG-3'，antisense/HindⅢ:5'-CCCAAGCTTTTAGGGGGTGCCCTCCCCGAG-3')，用高保真PCR擴(kuò)增hS100A9片段，15g/L瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收hS100A9片段。

1.2.2 hS100A9片段與載體 pGST-moluc的連接BamHⅠ和HindⅢ雙酶切hS100A9及 pGST-moluc，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化，DNA連接試劑盒連接，連接產(chǎn)物命名為pGST-hS100A9。

1.2.3 pGST-hS100A9的鑒定 以上連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后電轉(zhuǎn)入DH5α菌，并接種于含氨芐西林(Amp)100 μg/mL的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單個(gè)菌落接種于含Amp 100 μg/mL的LB培養(yǎng)基2 mL 中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng) 6 h，取 1.5 μL做hS100A9片段的菌液PCR。將菌液繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，取 5 μL送測(cè)序，5 μL 用 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。

1.3 大腸桿菌BL21的轉(zhuǎn)化

氯化鈣法制備感受態(tài)的大腸桿菌BL21，加重組質(zhì)粒 pGST-hS100A9置冰浴 30 min，37℃水浴2 min，冰浴2 min;轉(zhuǎn)入預(yù)熱至37℃的LB培養(yǎng)基1 mL中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)1 h。取轉(zhuǎn)化反應(yīng)液100 μL鋪于含 Amp 100 μg/mL的 LB平板培養(yǎng)，37℃過夜，挑取兩個(gè)菌落，接種到含Amp 100 μg/mL的LB培養(yǎng)基10 mL中，37℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒。

1.4 GST-hS100A9融合蛋白的表達(dá)

取上一步過夜培養(yǎng)物1.5 mL接種于含Amp 100 μg/mL的 LB培養(yǎng)基300 mL中，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)3 h，加入 IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)3 h，完成融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。4℃，5000 r/min離心10 min收集細(xì)菌沉淀，保存于－80℃或立即進(jìn)行蛋白分離純化。同步誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)照蛋白GST(其質(zhì)粒為pGST-moluc)。

1.5 融合蛋白的分離純化

每100 mL菌液的沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL重懸，加入蛋白酶抑制劑和終濃度為0.1%的Triton-X100，冰上超聲裂解細(xì)菌(參數(shù):振幅26%，超聲3 s，間隔3 s，總時(shí)間60 min)，冰上搖動(dòng)孵育30 min。4 ℃，10000 r/min離心20 min，取上清，每10 mL上清加入50%GS4BB混懸液400 μL，冰上搖動(dòng)孵育 3 h，4 ℃，1000 r/min 離心5 min，棄上清，冷PBS洗滌3次，去上清，加入洗脫緩沖液300 μL，冰上搖動(dòng)洗脫3 h，4℃，1000 r/min離心5 min，重復(fù)洗脫3次，上清即為所得融合蛋白。取洗脫液20 μL進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色、凝膠成像儀成像，Quantity One軟件分析純化效果，余分裝后于－80℃保存。

1.6 Western blot鑒定融合蛋白

取適量純化所得的融合蛋白，以GST蛋白為陰性對(duì)照，加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸后取10 μL上樣，行SDS-PAGE和Western blot鑒定。

1.7 融合蛋白的定量

按照說明書操作，在酶標(biāo)儀上測(cè)定540 nm波長處的吸光度(A)值，用A為縱坐標(biāo)、牛血清白蛋白(BSA)濃度(C)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，融合蛋白GST-hS100A9稀釋10倍后測(cè)定，并由此計(jì)算所制備的融合蛋白的濃度及產(chǎn)量。

1.8 GST-hS100A9對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響

按照CCK-8操作說明，在96孔板中接種濃度為2500個(gè)/孔的 MCF-7細(xì)胞懸液(培養(yǎng)基為含10%FBS 的 RPMI 1640)100 μL，37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱12 h后將培養(yǎng)基換為含1%FBS的RPMI 1640，同時(shí)加入干預(yù)因素，實(shí)驗(yàn)分為3組:空白對(duì)照組、GST對(duì)照組、GST-hS100A9組，后兩組分別加入相應(yīng)蛋白使其終濃度為100 μg/mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1，2，3 d后加入 CCK-8試劑 10 μL，培養(yǎng)箱孵育 2 h后在450 nm處波長測(cè)定A值。A值采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 hS100A9基因片段的獲得

用高保真PCR從pHAHA-hS100A9中擴(kuò)增hS100A9基因片段，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見約360 bp的條帶(圖1)。

圖1 高保真PCR獲得hS100A9基因片段Fig.1 hS100A9 gene from high fidelity PCR

2.2 pGST-hS100A9 的鑒定

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pGST-hS100A9，正確重組的質(zhì)?？梢缘玫郊s360 bp和5 kb的兩個(gè)片段。圖2所示酶切結(jié)果提示質(zhì)粒重組成功。將pGST-hS100A9送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果示hS100A9成功重組入質(zhì)粒pGST-moluc(結(jié)果未顯示)。

圖2 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定pGST-hS100A9Fig.2 pGST-hS100A9 digested with BamHⅠand HindⅢ

2.3 GST-hS100A9 的鑒定

3次洗脫共獲得融合蛋白GST-hS100A9溶液1.5 mL，將其與對(duì)照蛋白GST進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖3A所示，融合蛋白Mr為36000，GST Mr為26000，與預(yù)期值相符;用 Quantity One軟件分析純化效果，GST-hS100A9純度為94%。用hS100A9抗體針對(duì)GST-hS100A9和GST行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖3B所示，GST-hS100A9融合蛋白與抗體呈現(xiàn)特異反應(yīng)，而GST則與該抗體沒有反應(yīng)。

圖3 GST-hS100A9的SDS-PAGE鑒定(A)及Western blot鑒定(B)電泳圖Fig.3 SDS-PAGE(A)and Western blot(B)of GST-hS100A9

2.4 GST-hS100A9 的定量

BSA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.314 C+0.005，r=0.9962，線性范圍為 20 ～2000 μg/mL。本次菌液300 mL制備hS100A9-GST融合蛋白，3次洗脫共獲得融合蛋白GST-hS100A9溶液1.5 mL，測(cè)定其蛋白濃度為4 mg/mL，因此總量為6 mg。

2.5 GST-hS100A9抑制MCF-7的增殖

CCK-8測(cè)定GST-hS100A9對(duì)MCF-7增殖的影響結(jié)果見表1。可見，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)空白組和GST組的活細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05)，第1天 GST-hS100A9組與空白組及GST組無明顯差異(P＞0.05)，從第2天開始，GST-hS100A9組比空白組及GST組活細(xì)胞數(shù)減少，第3天分別為空白組和GST組的75%和76%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示GST-hS100A9抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。

3 討論

S100蛋白是一類具有EF-手型結(jié)構(gòu)的鈣調(diào)蛋白，目前發(fā)現(xiàn)該家族至少有25個(gè)成員，其中21個(gè)成員的基因定位在人染色體1q21上，該區(qū)染色體穩(wěn)定性差，易發(fā)生人染色體重排，與腫瘤關(guān)系密切[4-5]。S100A9是定位于該染色體上的S100家族成員之一。它是由嗜中性粒細(xì)胞分泌和表達(dá)的一種具有免疫原性的蛋白質(zhì)，有抑制細(xì)胞生長、抗菌、抑制巨噬細(xì)胞的活化的作用[6-7]。但近來研究發(fā)現(xiàn)，S100A9可促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中骨髓起源的抑制細(xì)胞(MD-SCs)和腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞(TAM)的產(chǎn)生，這兩種細(xì)胞能抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的免疫殺傷功能，產(chǎn)生促細(xì)胞生長的多種細(xì)胞因子[8-12]，S100A9作為腫瘤微環(huán)境中的重要因子，有效的調(diào)控著腫瘤的動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，因此進(jìn)一步探討S100A9在腫瘤中的作用及作用機(jī)制具有重要意義。

表1 GST-hS100A9作用不同時(shí)間對(duì)MCF-7增殖的影響(，n=3)Tab.1 The effects of GST-hS100A9 on cell proliferation of MCF-7 in different time(，n=3)

表1 GST-hS100A9作用不同時(shí)間對(duì)MCF-7增殖的影響(，n=3)Tab.1 The effects of GST-hS100A9 on cell proliferation of MCF-7 in different time(，n=3)

與空白組相比:1P＜0.05;與GST組相比:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with GST group:2P ＜0.05

組 別A4501 d 2 d 3 d空白組0.991 ±0.096 2.060 ±0.086 2.710 ±0.076 GST 組 1.072 ±0.068 2.092 ±0.072 2.646 ±0.075 GST-hS100A9 組 0.990 ±0.048 1.889 ±0.0791，2 2.024 ±0.0561，2

本文選擇pGEX系列表達(dá)載體表達(dá)GST-hS100A9融合蛋白來研究其生物學(xué)功能和作用。該表達(dá)載體表達(dá)的融合蛋白既易于制備，純度較高，且保持有外源蛋白的生物學(xué)活性。我們通過基因重組技術(shù)將hS100A9基因插入融合表達(dá)載體pGST-moluc中構(gòu)建了 pGST-hS100A9，經(jīng)過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，其所產(chǎn)生的兩個(gè)片段與限制性內(nèi)切酶圖譜相符，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-hS100A9。隨后利用谷胱甘肽偶聯(lián)球珠分離出融合蛋白，再經(jīng)含有還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液洗脫，離心后在上清中得到純化的融合蛋白。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行SDSPAGE和考馬斯亮藍(lán)染色以及Western blot鑒定，證實(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白為GST-hS100A9，且純度達(dá)94%，與通常報(bào)道的一步親和色譜可分離純化純度90%以上蛋白一致;這也進(jìn)一步證實(shí)了該融合蛋白質(zhì)粒構(gòu)建正確。BCA法測(cè)定誘導(dǎo)表達(dá)的菌液300 mL獲得了融合蛋白6 mg，產(chǎn)量高。且該蛋白可以抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，與Li等[13]報(bào)道的結(jié)果相符，為我們進(jìn)一步研究hS100A9的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供了良好的條件。

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