HPLC－MS/MS測(cè)定綠豆中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1

許 勇，王少敏，毛 丹，鄭 榮，王 柯，季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

黃曲霉毒素污染問(wèn)題，已經(jīng)成為世界各國(guó)密切關(guān)注的問(wèn)題之一。黃曲霉毒素是一組具有強(qiáng)毒性和致癌性的次級(jí)真菌代謝產(chǎn)物，全球性污染糧食及其制品，給人類的健康造成嚴(yán)重威脅［1］。在黃曲霉產(chǎn)生的十余種毒素中，黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的毒性及致癌性最強(qiáng)。中藥材或中成藥中黃曲霉毒素的分析方法的研究近年來(lái)發(fā)展十分迅速，已有研究表明中藥材及中成藥中黃曲霉毒素的污染不可忽視［2～5］。為了保證臨床用藥的安全性，本文建立了用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)中藥綠豆中的黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1進(jìn)行了測(cè)定。方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國(guó)Agilent公司1200液相色譜－API5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI);多功能真空樣品處理器;氮?dú)獯蹈蓛x(N－EVAP 112型，美國(guó) Organomation Associates，Inc公司);分析天平(BS2202/TE－612－L/CP225D型電子天平，德國(guó)Sartorius公司);HLB 柱(3mL/60mg，Waters，095A)。

1.2 試藥 黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(美國(guó)SUPELCO公司提供 Lot:LB 33367，黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1的濃度分別為 0.3 μg·mL－1、1.0 μg·mL－1、0.3 μg·mL－1、1.0 μg·mL－1);綠豆(批號(hào):090721，產(chǎn)地:浙江)。甲醇、乙腈均為色譜純(MERCK公司)，試劑均為分析純［中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件 色譜柱:Phenomenex SB－C18(2.0mm×50mm，4μm)。以 10mmol·L－1醋酸銨溶液為流動(dòng)相 A，以甲醇為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫;體積流量:1.0mL·min－1;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量10μL。

表1 流動(dòng)相條件

2.2 質(zhì)譜條件 經(jīng)過(guò)對(duì)毛細(xì)管出口電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終確定黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1質(zhì)譜條件 見(jiàn)表2。

表2 黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液，加50%甲醇制成含黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1濃度分別為 30 ng·mL－1、100 ng·mL－1、30 ng·mL－1、100 ng·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過(guò)二號(hào)篩)5 g，精密稱定，精密加入70%甲醇50mL，超聲處理30min，離心5min(離心速度2500 r·min－1)，精密吸取上清液 10mL，用水稀釋至20mL，搖勻，取10mL，通過(guò)已經(jīng)處理好的HLB(先用甲醇2mL洗脫，再用水2mL洗脫)柱(流速3mL·min－1)，隨后用 30%甲醇2mL 洗脫(流速6mL·min－1)，棄去洗脫液，再用1.5mL甲醇洗脫(流速1mL·min－1)，收集甲醇洗脫液，用水稀釋至2mL，搖勻，即得。

圖1 黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1對(duì)照品(A)、綠豆樣品(B)、綠豆加入對(duì)照品(C)、陰性對(duì)照(D)的總離子流色譜圖

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺綠豆的樣品按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。陰性樣品溶液在與黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1色譜峰相同位置處無(wú)干擾峰，表明樣品中其他成分對(duì)黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1對(duì)照品溶液，加75%甲醇配制成5個(gè)不同濃度的系列對(duì)照品溶液。取樣品5 g，一式5份，按正文所述方法制備供試品溶液，將供試品溶液于40℃氮吹至干，分別精密加入上述系列對(duì)照品溶液2mL，渦旋混勻，作為基質(zhì)混合對(duì)照品溶液。精密吸取各基質(zhì)混合對(duì)照品溶液10μL，進(jìn)樣分析，記錄各待測(cè)組分色譜峰面積，以各成分的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，各成分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸分析，校正曲線，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4.2 檢測(cè)限的測(cè)定 取基質(zhì)混合對(duì)照品溶液逐步稀釋后，進(jìn)樣，以峰高為基線噪音3倍計(jì)，黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的最低檢測(cè)限分別為 0.11 μg·kg－1、0.03 μg·kg－1、0.01 μg·kg－1、0.02 μg·kg－1。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取基質(zhì)對(duì)照品溶液(黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1濃度分別為 3 ng·mL－1、10 ng·mL－1、3 ng·mL－1、10 ng·mL－1)，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積，結(jié)果黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1峰面積的 RSD 值在0.8% ～2.0%范圍內(nèi)，表明測(cè)定精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 因樣品未檢出黃曲霉毒素，故采用加樣方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)5 g(未檢出黃曲霉毒素)，一式6份，精密稱定，精密加入黃曲霉毒素對(duì)照品溶液0.3mL，按正文方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表4，表明測(cè)定重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取中間濃度回收率試驗(yàn)的供試品溶液，室溫下放置 0、2、4、12、46 h，進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1濃度，其 RSD 值在 0.5% ～ 1.1% 范圍內(nèi)，表明供試品溶液在46 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)5 g(未檢出黃曲霉毒素)，一式9份，以3份為一組，分別精密加入黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1對(duì)照品溶液各 0.15、0.3、0.5mL，精密加入70%甲醇50mL，余同供試品溶液制備方法制得加樣回收率供試品溶液。依法測(cè)定，計(jì)算回收率及相應(yīng)RSD值，結(jié)果表明，本方法回收率試驗(yàn)結(jié)果良好，結(jié)果見(jiàn)表5～7。

表5 低濃度添加水平回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)(黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1 的添加濃度分別為 0.9 μg·kg－1、3 μg·kg－1、0.9 μg·kg－1、3 μg·kg－1)

表6 中間濃度添加水平回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)(黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1 的添加濃度分別為 1.8 μg·kg－1、6 μg·kg－1、1.8 μg·kg－1、6μg·kg－1)

表7 高濃度添加水平回收率試驗(yàn)結(jié)果(%)(黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1 的添加濃度分別為 3 μg·kg－1、10 μg·kg－1、3 μg·kg－1、10 μg·kg－1)

2.4.7 樣品測(cè)定 按擬訂方法測(cè)定綠豆樣品，結(jié)果未檢出黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1。

3 討論

3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察及其消除和補(bǔ)償措施 基質(zhì)效應(yīng)指樣品中除目標(biāo)分析物以外的其他成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響，即基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物能力的干擾。根據(jù)基質(zhì)對(duì)檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)值的不同影響，可分為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和減弱效應(yīng)。增強(qiáng)效應(yīng)即基質(zhì)成分的存在減少了色譜系統(tǒng)活性位點(diǎn)與待測(cè)物分子作用的機(jī)會(huì)，使得待測(cè)物檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)的現(xiàn)象;減弱效應(yīng)是指基質(zhì)成分的存在使儀器檢測(cè)信號(hào)減弱的現(xiàn)象。不同的待測(cè)物由于化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同，在不同種類的基質(zhì)中表現(xiàn)為不同的基質(zhì)效應(yīng)，本文在實(shí)驗(yàn)中對(duì)此進(jìn)行了研究。

試驗(yàn)中，分別以混合對(duì)照品溶液和基質(zhì)混合對(duì)照品溶液制備兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)加樣回收率結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1存在基質(zhì)減弱的現(xiàn)象?；旌蠈?duì)照品溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的回收率結(jié)果明顯偏低。因此，為了保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行方法學(xué)的研究。

4 結(jié)論

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的中藥中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，多數(shù)為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫親和柱熒光光度法。但是，因?yàn)橹兴幍某煞州^為復(fù)雜，化學(xué)成分干擾較多，用ELISA試劑盒測(cè)定中藥中黃曲霉毒素，假陽(yáng)性率較高，不同廠家的試劑盒及各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果差異較大。免疫親和柱熒光光度法是2010年版《中國(guó)藥典》附錄中收載的中藥中黃曲霉素G2、G1、B2、B1的通用測(cè)定方法。但此方法所用的免疫親和柱價(jià)格比較昂貴，且有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。與上述方法相比較，本法采用HLB柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化后，通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)樣分析，即降低了分析的成本，提高了檢測(cè)的靈敏度，又減少了假陽(yáng)性，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性，有較強(qiáng)的實(shí)用性。

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