王 艷,丁 莎,駱 俊,費(fèi)永俊 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州434025)
認(rèn)識植物對水澇脅迫響應(yīng)機(jī)理,揭示其適應(yīng)機(jī)制,從而合理地選擇和定向培育耐澇性品種,減輕淹水危害,對于我國花卉生產(chǎn)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[1]。牡丹 (Paeonia suffruticosa)系芍藥科芍藥屬,是我國的國花之一,有著數(shù)千年自然生長和兩千多年的人工栽培歷史,具有重要的觀賞價值、藥用價值、食用價值和商品價值[2]。本研究旨在研究澇漬脅迫下牡丹葉片的葉綠素含量、SOD活性、丙二醛含量以及脯氨酸含量等幾個生理指標(biāo)的響應(yīng),分析牡丹的抗?jié)承?為高溫多雨地區(qū)的品種選擇提供參考。
供試牡丹苗木為二年生實(shí)生苗,均采用無土栽培方式,種源為湖北五峰野生品種,已經(jīng)馴化栽培8 a,能正常開花結(jié)實(shí)。在澇漬處理之前水肥常規(guī)管理,在溫室環(huán)境中生長正常。
隨機(jī)挑選長勢較為一致的9盆牡丹,移栽于高35 cm、直徑25 cm的塑料盆中,栽培基質(zhì)為蛭石∶珍珠巖∶泥炭土∶陶粒=3∶1∶4∶1。設(shè)置3個不同的土壤含水量梯度 (W1水位:淹至苗木基質(zhì)1/3,W2水位:淹至苗木基質(zhì)2/3,W3水位:淹至苗木基質(zhì)3/3),對牡丹幼苗分別進(jìn)行澇漬脅迫處理,每個梯度處理3盆。移栽后,按設(shè)計(jì)要求控水,每天補(bǔ)充失去的水分,在淹水第2、4、6 d分別取牡丹下方枝條上的葉片用于測定。
(1)葉綠素含量的測定 將采摘的葉樣快速洗凈擦干,稱取0.1 g,剪碎后放入盛25 mL浸提液的玻璃瓶中,密封后置于黑暗低溫處,處理24 h以上,直至瓶中葉肉組織完全變?yōu)榘咨?將浸提液于722N型可見分光光度計(jì)上測定645 nm和663 nm波長下的光密度D645和D663[3]。浸提液為丙酮∶95%乙醇∶蒸餾水=4.5∶4.5∶1.0,測定值用于計(jì)算葉綠素a濃度 (Ca)、葉綠素b濃度 (Cb)和葉綠素總含量 (Ct)。
葉綠素總含量 (mg/g)=葉綠素總濃度 (mg/L)×提取液總體積(L)×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重 (g)。
(2)SOD活性的測定 稱取鮮葉樣品0.5 g,用pH 7.0的磷酸緩沖液5 mL在研缽中研磨提取,提取液于8 000 r/min冷凍離心15 min,上清液用于MDA含量和SOD活性的測定。測定SOD活性的試劑配制及用量:0.05 mol/L磷酸緩沖液 (pH 7.8)3.1 mL(空白為3.2 mL),12 mg/mL EDTA 0.2 mL,10 mg/mL L-甲硫氨酸0.2 mL,0.l mg/mL核黃素吸取上清液0.2 mL,1 mg/mL NBT 0.2 mL,0.1 mL提取酶液,空白不加酶液。反應(yīng)總體積為4 mL,采用具塞試管。4 000 lx光照30 min,遮黑布終止反應(yīng),置560 nm處測定光密度。
SOD活性 (抑制NBT光還原%)=(Do-D)/Do×100/50×V總/V取/樣葉鮮重 (g),其中,Do為空白光密度值,D為加酶液光密度值[4]。
(3)丙二醛 (MDA)含量的測定 取上述離心后的上清液1.5 mL,加入0.5%硫代巴比妥酸(TBA)混合物2.5 mL于100℃沸水中,加熱20 min,迅速冷卻,于3 500 r/min離心10 min,上清液分別測定532 nm、600 nm處波長下光密度D532和D600[5]。
MDA含量 (nmol/g)=[(D532-D600)/0.155×提取液總量/測定時提取液用量反應(yīng)體系總體積]/樣品鮮重 (g)[6]。
(4)游離脯氨酸 (PRO)的測定 取葉0.1 g,剪碎后放入試管,加入 3%的磺基水楊酸溶液5 mL,于沸水浴中浸提10 min。冷卻后,吸取提取液2 mL于另一支試管中,再加水2 mL、冰乙酸2 mL和2.5%的酸性茚三酮溶液4 mL,置沸水浴中顯色60 min。冷卻后,加入甲苯萃取紅色物質(zhì)4 mL。靜置后,取甲苯相測定520 nm波長處的吸收值。在1~10 μ g/mL脯氨酸濃度范圍內(nèi)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。取標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL,加入3%磺基水楊酸2 mL、冰乙酸2 mL和2.5%茚三酮溶液4 mL,置沸水浴中顯色60 min。冷卻后,加入甲苯萃取紅色物質(zhì)4 mL。靜置后,取甲苯相測定520 nm波長處的光密度值,依據(jù)脯氨酸量和相應(yīng)吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定取2 mL上清液,加水2 mL,再加入冰乙酸等顯色劑,同標(biāo)準(zhǔn)曲線程序進(jìn)行顯色、萃取和比色。
圖1表明,在淹水第4 d,W1、W2、W3之間葉綠素含量差異不大,而第6 d 3個處理的葉綠素含量均顯著降低,且W3處理的牡丹在整個處理過程中葉綠素含量最低。W3的牡丹下降趨勢很明顯,很有規(guī)律,但是W1、W2處理的葉綠素含量第4 d比第2 d的含量高。
由圖2可知,不同水分處理的牡丹葉片中SOD活性總體呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,W3在第4 d SOD活性急劇下降,且與其他處理表現(xiàn)出極顯著差異。但整體表現(xiàn)為W1>W(wǎng)2>W(wǎng)3,表明土壤含水量越多,SOD活性越弱,這是因?yàn)橥寥浪置{迫使SOD合成受阻。第6 d SOD活性增加,這是牡丹提高自身抵御能力,適應(yīng)外界環(huán)境變化的結(jié)果。
圖1 不同土壤含水量處理對牡丹葉片葉綠素含量的影響
圖2 不同土壤含水量對牡丹葉片 S OD含量的影響
由圖3可知,不同水份處理的牡丹葉片中丙二醛的含量總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在第4 d含量不斷增加。第2 d W3含量最高,且與其他處理表現(xiàn)出極顯著差異。但當(dāng)?shù)降? d時,丙二醛含量反而降低,說明牡丹在一定的土壤含水量范圍內(nèi)具有一定的忍耐能力,但當(dāng)土壤含水量超過牡丹忍耐極限時,植株就會受到較為嚴(yán)重的危害。
圖3 不同土壤含水量處理對牡丹葉片丙二醛含量的影響
由圖4可知,不同水分處理的牡丹葉片中脯氨酸的含量總體呈現(xiàn)出上升的趨勢,表明土壤含水量的增加促進(jìn)了牡丹葉片中脯氨酸含量的增加。處理初期上升較快,隨著處理時間的延長,脯氨酸含量呈緩慢增加的趨勢。W2處理下牡丹脯氨酸含量增加最高,且與其他處理表現(xiàn)出極顯著差異。
圖4 不同土壤含水量處理對牡丹葉片脯氨酸含量的影響
牡丹對高土壤含水量的忍受能力受多種因素的影響,不同的澇漬處理的牡丹的指標(biāo)的反應(yīng)不一樣,因此用單一的指標(biāo)難以準(zhǔn)確的反應(yīng)耐澇能力。本研究通過對同一品種的牡丹進(jìn)行不同的水分處理進(jìn)行耐澇能力的綜合評價,具有可信性。
在澇漬處理的初期,不同梯度下處理的牡丹各項(xiàng)生理指標(biāo)會出現(xiàn)短暫的反?,F(xiàn)象,但在后期由于抗性加強(qiáng)會慢慢趨向穩(wěn)定,表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性。葉綠素作為葉綠體的重要組成部分,第6 d較第4 d的處理極顯著降低,表明逆境延長使正常的生理代謝發(fā)生紊亂。SOD活性隨著水澇脅迫的加深,表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,因?yàn)镸DA的積累抑制了SOD,使其下降。第6 d SOD活性增加,這是牡丹提高自身抵御能力,適應(yīng)外界環(huán)境變化的結(jié)果。MDA含量隨處理時間延長、水分含量增加呈先上升后下降的趨勢,這可能是在處理的后期,牡丹生理代謝紊亂。在逆境環(huán)境下植物體內(nèi)脯氨酸積累量與逆境水平和植物對這種逆境的抗性有關(guān),脯氨酸的積累可提高植物體的抗性。本研究結(jié)果表明,隨著處理時間延長、水份含量增加,在第6 d含量都趨于穩(wěn)定,說明游離脯氨酸含量、丙二醛含量、過氧化氫酶活性能更好地反映牡丹的耐澇能力。而且在整個處理過程中,牡丹都沒有出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象,說明經(jīng)過8 a的馴化,湖北五峰的野生牡丹品種對澇漬環(huán)境已經(jīng)有了一定的適應(yīng)性。
近十余年,國內(nèi)外展開了對牡丹的系統(tǒng)研究,主要集中在資源的調(diào)查、品種分類、引種栽培、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、生理等方面。生理方面的研究主要集中在花期調(diào)控、切花采后生理和貯藏保鮮。在牡丹抗?jié)碀n脅迫耐性方面的報道卻很少。牡丹各組織 (根、莖、葉)對牡丹抗逆性有著怎樣的影響,還有待進(jìn)行更深層次的研究。
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