蝴蝶蘭葉斑病病原真菌的分離與鑒定

崔亞華,余知和 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

蝴蝶蘭 (Phalaenopsisamabilis)為蘭科 (Orchidaceae)蝴蝶蘭屬植物,因花形似蝶而得名,大多數(shù)分布于熱帶地區(qū),如中國臺(tái)灣和東南亞的泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等地,已發(fā)現(xiàn)有70個(gè)原生種,其中我國原產(chǎn)6個(gè)[1]。蝴蝶蘭株型優(yōu)美、花色豐富、色彩絢麗、花姿優(yōu)雅,素有 “蘭中皇后”之美譽(yù),具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2,3]。近年來,隨著栽培面積及栽培區(qū)域的擴(kuò)大,蝴蝶蘭病害也隨之大量發(fā)生。一些真菌或細(xì)菌性病害,因傳播速度快、潛伏期長等特征,常導(dǎo)致全株枯萎或死亡,失去觀賞價(jià)值,嚴(yán)重影響蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn),造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前已報(bào)道的蝴蝶蘭常見真菌病害有炭疽病、白絹病、疫病、灰霉病、葉斑病等[5～7]。

筆者在蝴蝶蘭葉片上發(fā)現(xiàn)的病害癥狀初期為淡橙黃色、近圓形小斑,逐漸擴(kuò)大成不規(guī)則的黑褐色病斑,邊緣模糊,后期葉片迅速失水黃化、枯萎,最后葉片斷裂、脫落至整株死亡。為了明確該病害的病原,并為有效防治該病害提供依據(jù),筆者對(duì)其病原菌進(jìn)行了分離與鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蝴蝶蘭病株采自湖北省荊門市荊門福農(nóng)生物科技有限公司蝴蝶蘭生產(chǎn)基地,苗齡為100～120 d。分離獲得的真菌菌株保藏于長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 病原菌分離

剪取蝴蝶蘭葉片病健交界處,用自來水沖洗干凈,再用吸水紙吸干組織表面水分,用75%乙醇處理20～30 s,無菌水沖洗3次,2%次氯酸鈉浸泡3 min,無菌水沖洗5次,然后將葉片切成長度約5 mm的小方片置于PDA平板上 (培養(yǎng)皿直徑9 cm),每皿5小片,3個(gè)重復(fù),25℃恒溫暗培養(yǎng)。為抑制細(xì)菌生長,配制PDA時(shí)在滅菌前每升培養(yǎng)基中加入2 mL氯霉素[8]。待組織塊周圍長出菌絲,挑取菌絲邊緣菌塊,經(jīng)多次轉(zhuǎn)接獲得純培養(yǎng)物,PDA斜面4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株形態(tài)特征觀察

純化菌株接種于PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng),記錄菌株生長速度,觀察菌落特征,挑取菌絲經(jīng)乳酸石碳酸棉蘭染液染色制片后在顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)特征。

1.4 基因組DNA提取及ITS序列測(cè)定

將純化菌株接種至PDA液體培養(yǎng)基中,25℃恒溫振蕩培養(yǎng)4～6 d,收集菌絲體。按CTAB法提取基因組DNA[9],用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量和濃度。選擇真菌核糖體rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCT TAT TGATATGC-3'),利用Applied Biosystems 2 720 Thermal Cycler(美國ABI公司)擴(kuò)增5.8S rDNA及其兩側(cè)ITS1和ITS2基因片段。反應(yīng)體系為25 μ L,其組分為:10×PCR 緩沖液2.5 μ L,10 μ m 引物1.25 μ L,10 mmol/L dNTP 0.5 μ L,2 U/μ L TaqDNA 聚合酶0.5 μ L(試劑均為鼎國公司產(chǎn)品), 模板 DNA 2 μ L, 雙蒸水17 μ L。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性2 min,35個(gè)循環(huán),94℃變性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) (武漢)有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及其培養(yǎng)性狀

蝴蝶蘭葉片病斑經(jīng)常規(guī)組織分離得到5個(gè)菌株,分別編號(hào)為 Pa1、Pa2、Pa3、Pa4、Pa5,具體分離結(jié)果見表1。

表1 蝴蝶蘭病原真菌分離結(jié)果

菌株P(guān)a1～Pa4在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng),約7 d長滿9 cm平皿,菌落白色,氣生菌絲較發(fā)達(dá),呈絮狀,菌絲分枝狀,有分隔。

菌株P(guān)a5在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng),生長緩慢,7 d菌落直徑約2 cm,墨綠色,菌絲致密,呈絨狀,菌絲細(xì)長,較少分枝。Pa1～Pa4的菌落培養(yǎng)特征基本一致,而Pa5與上述4個(gè)菌株有顯著不同,因此初步將其劃分為2個(gè)分類單元。

2.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

為進(jìn)一步確定所得病原菌的分類地位,選取2個(gè)代表菌株P(guān)a1、Pa5對(duì)其rDNA-ITS序列進(jìn)行分析。測(cè)序結(jié)果表明,菌株 Pa1、Pa5 ITS序列長度分別為565 bp和634 bp(GenBank登錄號(hào)依次為JF436948,JF436949),經(jīng)BLAST[10]分析,Pa1的ITS序列與腐皮鐮刀菌 (Fusarium solani)近500個(gè)菌株的同源性高,E值為0.0,其中,與腐皮鐮刀菌分離物F.S.0613 ITS區(qū)段 (gb|HM064429.1|)的Identities=561/563(99%),Score值為1 100 bits(555)。

Pa5的ITS序列與瓶霉菌屬 (Phialophora sp.)的3個(gè)菌株的同源性高,E值為0.0,其中,與尖孢瓶霉菌 (Phialophora oxyspora)ITS區(qū)段 (dbj|AB190870.1|)Score=1 207 bits(609),Identities=616/617(99%),Gaps=1/617(0%)。

基于Landeweert等[11]對(duì)真菌分子鑒定,綜合形態(tài)觀察和序列數(shù)據(jù)分析結(jié)果,將菌株P(guān)a1鑒定為腐皮鐮刀菌,Pa5初步鑒定為瓶霉菌。

3 討論

本研究從湖北荊門福農(nóng)生物科技有限公司蝴蝶蘭生產(chǎn)基地的蝴蝶蘭葉片病斑部位分離到5株真菌,形態(tài)特征觀察及rDNA-ITS序列分析結(jié)果表明,這5個(gè)菌株為2個(gè)分類單元,其中1個(gè)鑒定為腐皮鐮刀菌。

腐皮鐮刀菌是一類分布廣泛的土傳病原菌,可侵染多種植物 (糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物及觀賞植物),引起植物的根腐、莖腐等病害。康峰等[12]采用形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定方法對(duì)新疆甜瓜根腐病病原菌進(jìn)行研究,確定病原菌為腐皮鐮刀菌。林蘭穩(wěn)等[13]經(jīng)顯微鏡直接檢查、病原菌分離培養(yǎng)觀察、致病性測(cè)定及田間病害調(diào)查,初步確定廣東鶴山粉葛根腐病是由腐皮鐮刀菌侵染引起的。周亞麗等[14]曾報(bào)道腐皮鐮刀菌是引致長春地區(qū)蝴蝶蘭根腐病的致病菌。本研究的腐皮鐮刀菌分離于蝴蝶蘭葉片部位,其根部并未表現(xiàn)出真菌病害的特征,兩者不同的侵染機(jī)制還有待深入研究。

據(jù)Lopez等[15]報(bào)道,尖孢瓶霉菌是引起馬足分支菌病的病原菌。而本研究還從蝴蝶蘭葉片病斑部位分離到1株與尖孢瓶霉菌親緣關(guān)系十分近的真菌,因未按照科赫法則進(jìn)行致病性測(cè)定,故該菌株是否為蝴蝶蘭病害的病原菌,或者是否與腐皮鐮刀菌存在復(fù)合侵染,均有待于進(jìn)一步研究。

[1]李 軍,許大熊,張秀珊,等.蝴蝶蘭種質(zhì)資源保存技術(shù)研究初探[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(7):69-72.

[2]謝啟鑫,繆南生,宋小民,等.蝴蝶蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析 [J].西北植物學(xué)報(bào),2010,30(7):1331-1336.

[3]胡松華.熱帶蘭花 [M].北京:中國林業(yè)出版社,2002.45-46.

[4]譚 巍.蝴蝶蘭常見真菌、細(xì)菌性病害及防治措施 [J].北方園藝,2006,(2):128-129.

[5]陳愛華.蝴蝶蘭主要病害的發(fā)生與防治[J].福建熱作科技,2003,28(4):21-23.

[6]易綺斐,劉東明,陳紅峰,等.蘭花主要病害及其防治 [J].植物保護(hù),2004,(1):71-72.

[7]鐘士傳.蝴蝶蘭常見病害及防治[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(8):1546-1547.

[8]方中達(dá).植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1979.115-116.

[9]Zolan M E,Pukkila P J.Inheritance of DNA Methylation in Coprinus cinereus[J].Molecular and Cellular Biology,1986,6:195-200.

[10]Altschul,Stephen F,Madden T L,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Res,1997,25:3389-3402.

[11]Landeweert R,Leeflang P,Kuyper T W,et al.M olecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69:327-333.

[12]康 峰,王賢磊,李 冠.新疆甜瓜枯萎病、根腐病病原菌鑒定 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,47(6):1166-1171.

[13]林蘭穩(wěn),李兆雄,何熊威,等.粉葛根腐病的病原鑒定[J].生態(tài)環(huán)境,2003,12(4):516-517.

[14]周亞麗.長春地區(qū)蝴蝶蘭根腐病病原菌鑒定及化學(xué)防治效果研究 [D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[15]Lopez M J,Robinson S O,Cooley J,et al.Molecular identification of Phialophoraoxyspora as the cause of mycetoma in a horse[J].Journal of the American Veterinary Medical Association,2007,230:84-88.