骨折一號(hào)方對家兔骨折VEGF和BMP 2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

易 洋,鮑運(yùn)平,龔朝霞朱正榮,彭禮林,駱華松 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院荊州市第一人民醫(yī)院骨科,湖北荊州434000)李軍川 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院荊州市第一人民醫(yī)院病理科,湖北荊州434000)

骨折一號(hào)方是我科協(xié)定方,臨床實(shí)踐證實(shí)其療效卓著,為進(jìn)一步深入研究骨折一號(hào)方的作用機(jī)理,我們設(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn)。采用家兔橈骨中下1/3處1.5mm骨質(zhì)缺損的動(dòng)物模型,應(yīng)用組織學(xué)、免疫組化方法對骨折一號(hào)方對骨折愈合的作用和骨折愈合過程中骨痂血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達(dá)的影響進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)藥物 骨折一號(hào)方由荊州市第一人民醫(yī)院制劑科提供。處方組成:澤蘭、二花、紅花、三七等。用傳統(tǒng)煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,備用。生理鹽水、青霉素 (華北制藥)均由荊州市第一人民醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 VEGF、BMP-2試劑盒 (即用型,武漢博士德生物有限公司提供)、臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)LDZS-2(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、HC-TP12B-1型天平 (北京醫(yī)用天平廠)、全自動(dòng)切片機(jī)RMZ145(德國萊卡)、電熱恒溫水箱BHW(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)、全自動(dòng)病理切片包埋機(jī) (德國萊卡EGll60)、DJS-941型電動(dòng)石膏鋸 (長江大學(xué)提供)、電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-1(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)、顯微鏡MICROPHOT-FXA(日本NIKON)、外科常用器械 (由長江大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康8月齡雄性新西蘭大白兔60只,體質(zhì)量2.5～3.0kg,由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境下 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),自由進(jìn)食顆粒飼料,飲消毒水,室溫控制在 (20±2)℃,濕度60%,12-12間隔照明,定期紫外線消毒與排風(fēng)。

1.2 方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用0.3%戊巴比妥鈉按30mg/kg體質(zhì)量耳緣靜脈注射麻醉后建立動(dòng)物模型,右側(cè)橈骨術(shù)野處剪毛,2%碘酒、70%酒精消毒,取前臂外側(cè)切口,暴露橈骨中段,注意保護(hù)橈動(dòng)、靜脈,用兩把骨膜剝離子將橈骨撬起,DJS-941型電動(dòng)石膏鋸造成橈骨中段1.5mm的骨缺損。以出現(xiàn)假性關(guān)節(jié)為準(zhǔn)。徹底止血,關(guān)閉切口。手術(shù)過程均在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。術(shù)后分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食,不做固定。術(shù)后進(jìn)行3d抗感染治療,給予青霉素80萬單位肌肉注射,1次/d。造模成功后隨機(jī)分為3組,空白組 (A組)、生理鹽水對照組 (B組)和骨折一號(hào)方組 (C組),每組20只。

1.2.2 給藥方法 用傳統(tǒng)煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,按 “動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”[1]折算成等效劑量,2ml/100g體質(zhì)量灌胃,從造模后第1天開始,2次/d,直至動(dòng)物被處死。

1.2.3 標(biāo)本處理 術(shù)后第3、6、9、14天每組隨機(jī)抽取5只家兔,采用空氣栓塞法處死,取樣時(shí)均截取右側(cè)橈骨,包括原骨折斷端及遠(yuǎn)近端各長約1.5cm的正常骨質(zhì),并剔除其上的軟組織。置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40g/L的多聚甲醛 (含1‰DEPC)4℃下固定24h。

1.2.4 組織學(xué)檢查 以骨折端中央為中心縱行剖開骨段,經(jīng)系列酒精脫水、透明、浸蠟,剖面向下,低熔點(diǎn)石蠟包埋。用萊卡自動(dòng)切片機(jī)切成厚度6μ m的蠟片,將蠟片分別展于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上,標(biāo)明相應(yīng)的組織號(hào)碼,置于干燥箱中,42℃烤片48h。采用HE染色對各組標(biāo)本的骨折愈合情況進(jìn)行觀察評價(jià)。

1.2.5 VEGF表達(dá)檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)的VEGF免疫組化S-P試劑盒對標(biāo)本VEGF的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢查。

1.2.6 BMP-2表達(dá)檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)的BMP-2免疫組化S-P試劑盒對標(biāo)本BMP-2的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢查。

1.2.7 圖像分析 NIKON MICROPHOT-FXA顯微鏡的光源設(shè)定在電壓4.9V,物鏡固定為×40,光柵孔徑為0.25mm,曝光時(shí)間為0.165s,色溫為5500K,敏感度為M。拍攝在攝像機(jī)的鏡頭打開無組織和鏡頭完全被遮蔽狀態(tài)下的照片,作為光密度分析中黑色階和入射色階的校準(zhǔn)圖像。以骨折為中心對骨折斷端附近的骨干細(xì)胞、骨外膜、骨內(nèi)膜、血腫、纖維骨痂、軟骨骨痂、骨小梁、小梁間組織及骨髓組織各取兩個(gè)高倍鏡視野。用Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件,對陽性反應(yīng)細(xì)胞的平均光密度值(MOD)進(jìn)行分析。簡要分析步驟:打開Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件,用校準(zhǔn)圖像的灰度值設(shè)定光密度系統(tǒng)的黑色階和入射色階,并將光密度設(shè)為系統(tǒng)默認(rèn)值。打開需要測量的圖像,用選擇顏色中的吸管工具選擇圖像中的棕黃色陽性反應(yīng)區(qū)域,并保存選擇的顏色數(shù)據(jù),根據(jù)大量圖像調(diào)整顏色數(shù)據(jù),確定標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù),其他圖像用此數(shù)據(jù)自動(dòng)選取圖像中陽性表達(dá)區(qū)域。使用AOI工具劃定需要測量的組織范圍,并手工去除噪點(diǎn)后計(jì)算該組織陽性表達(dá)細(xì)胞的MOD值,保存測量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

術(shù)后第3天,各組切片顯示以纖維組織為主,可見間充質(zhì)細(xì)胞增殖活躍,內(nèi)有毛細(xì)血管及炎性細(xì)胞;術(shù)后第6、9天,骨折一號(hào)方組膠原纖維較多,分化較成熟,對照組膠原纖維較少。術(shù)后第14天,骨折一號(hào)組有大量軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞,成纖維細(xì)胞多呈圓形,成骨細(xì)胞較大,細(xì)胞外基質(zhì)生成較多;空白組及對照組膠原纖維較多,軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)量相對較少,排列稀疏。

2.2 各組標(biāo)本骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)

各組標(biāo)本在骨折愈合不同時(shí)間點(diǎn)骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)情況見表1。

2.3 各組標(biāo)本骨干細(xì)胞BMP-2表達(dá)

各組標(biāo)本在骨折愈合不同時(shí)間點(diǎn)骨干細(xì)胞BMP-2表達(dá)情況見表2。

表1 不同觀察時(shí)間各組標(biāo)本骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)情況

表2 不同觀察時(shí)間各組標(biāo)本骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)情況

3 討 論

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜過程,經(jīng)膠原合成、膠原纖維內(nèi)鈣化、骨化等,最終形成具有生物力學(xué)特性的骨組織[2]。近年的研究已經(jīng)證明,影響骨折愈合的因素有很多,但目前一般認(rèn)為血管方面因素可能是影響骨折修復(fù)的主要因素之一。已有研究表明,EGF可以促進(jìn)創(chuàng)傷后的血管生成和骨形成[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)中VEGF表達(dá)檢測結(jié)果顯示,骨折后斷端均有VEGF表達(dá)。術(shù)后第3、9天出現(xiàn)兩個(gè)峰值。我們對各時(shí)相點(diǎn)VEGF表達(dá)量作比較分析后發(fā)現(xiàn),試藥組較對照組各時(shí)相點(diǎn)VEGF表達(dá)量均明顯增高,表明骨折一號(hào)方有促進(jìn)骨折后VEGF表達(dá)的作用,且在VEGF表達(dá)量下降過程中可明顯減慢下滑速度,使局部VEGF高表達(dá)維持較長時(shí)間 (術(shù)后第14天)。我們推斷,骨折一號(hào)方在骨折愈合過程中,具有正向調(diào)高VEGF表達(dá)水平的能力,同時(shí)可減緩表達(dá)峰值后表達(dá)量下降的速度,延長局部VEGF高表達(dá)時(shí)間,促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖,使骨折斷端血循環(huán)重建及成骨過程加快,縮短骨折愈合時(shí)間。

BMP-2是公認(rèn)的最主要的骨形成調(diào)控因子,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證明BMP-2有很強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力[5-6]。本實(shí)驗(yàn)BMP-2表達(dá)檢測結(jié)果顯示,骨折后斷端均有BMP-2表達(dá)。我們所觀察的各時(shí)相點(diǎn)未出現(xiàn)峰值,而是呈兩條近乎平行線,隨時(shí)間的推移而呈增高趨勢。這可能與我們所選的觀察時(shí)相點(diǎn)相對短有關(guān)。在各時(shí)相點(diǎn),骨折一號(hào)方組BMP-2表達(dá)均高于對照組和空白組 (P＜0.05)。由此推測,骨折一號(hào)方對BMP-2的合成、分泌具有一定的干預(yù)作用,能增加其表達(dá)量,從而促進(jìn)骨折愈合和縮短骨折愈合時(shí)間。

綜上所述,骨折一號(hào)方能顯著增高骨折愈合各時(shí)相點(diǎn)VEGF、BMP-2的表達(dá)量,使骨折斷端血循環(huán)重建及成骨過程加快,這可能是其產(chǎn)生臨床療效的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)僅研究了骨折一號(hào)方對骨折早期的影響,其對骨折中后期的影響有待進(jìn)一步探討。

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