MS-275聯(lián)合低劑量順鉑對(duì)小鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究

張海元,許光華,張 靜 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北荊州434023)

順鉑 (cisplatin,DDP))是臨床應(yīng)用最為廣泛的一種抗癌藥物,通過(guò)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的分子生物學(xué)研究顯示,鉑類藥物的主要作用機(jī)制是通過(guò)損傷DNA,使細(xì)胞進(jìn)入G1期生長(zhǎng)抑制,并誘導(dǎo)損傷嚴(yán)重的細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)[1]。但順鉑副作用較大,順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴(yán)重?fù)p害,另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時(shí)易引起耐藥性,故臨床上如何減小順鉑的細(xì)胞毒性和耐藥性是目前面臨的重要課題。MS-275屬于苯甲酰胺類去乙酰酶 (HDAC)抑制劑,可上調(diào)p21基因的表達(dá),對(duì)多個(gè)小鼠的人腫瘤模型都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑瘤作用[2]。本課題擬采用低劑量的順鉑和MS-275聯(lián)合應(yīng)用,以探討二者是否具有協(xié)同作用,是否能減少肝癌患者順鉑的使用劑量,降低順鉑對(duì)患者的毒副作用及耐藥性。通過(guò)本項(xiàng)目的實(shí)施,有望獲得全新的聯(lián)合抗腫瘤藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

H22肝癌細(xì)胞株由新加坡國(guó)立大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng),小鼠腹水傳代。6～8周齡健康小鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量18～22g。DDP購(gòu)于錦州九泰藥業(yè)公司,MS-275購(gòu)于德國(guó)Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 無(wú)菌操作,取H22小鼠腹水,臺(tái)盼藍(lán)染色,光鏡下瘤細(xì)胞計(jì)數(shù),活瘤細(xì)胞＞90%,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml,分別取0.2ml于右腋皮下注射,制成實(shí)體型荷瘤鼠模型,2周后于小鼠右腋皮下形成H22肝癌細(xì)胞系移植瘤。

1.2.2 動(dòng)物分組與治療 40只荷瘤小鼠隨機(jī)分成4組,即對(duì)照組 (生理鹽水0.2ml)、MS-275組(2mg/kg)、DDP組 (10mg/kg)、聯(lián)合治療組 (MS-275+DDP組),每組10只。每組荷瘤小鼠分別進(jìn)行腹腔內(nèi)注射,每周2次,共2周。在最后一次注射治療結(jié)束后第2周,用頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠,觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 瘤重稱取及腫瘤抑制率的計(jì)算 小鼠處死后,分別取出腫瘤瘤體,剝離干凈后,用濾紙擦拭干凈,電子天平稱取瘤重,并按公式計(jì)算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重)×100%。

1.2.4 腫瘤組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 切取上述各組小鼠腫瘤組織,分別經(jīng)40g/L戊二醛及10g/L四氧化鋨預(yù)固定和固定后,用乙醇及丙酮逐級(jí)脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,制作0.5μ m厚薄切片,醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色,利用透射電鏡觀察。

1.2.5 免疫組化檢測(cè) 免疫組化染色采用SP法,參照SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。切取小鼠腫瘤組織,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋并切片,檢測(cè)移植瘤組織中半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)及微血管密度 (MVD)的測(cè)定。在MVD的測(cè)定中,用CD31抗體標(biāo)記微血管。

免疫組化結(jié)果判斷:胞漿內(nèi)棕黃色顆粒為caspase-3、VEGF、CD31陽(yáng)性表達(dá) (CD31抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞);微血管密度計(jì)算方法:棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞族代表一條單獨(dú)微血管。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用χ2分析檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 順鉑聯(lián)合MS-275對(duì)肝癌移植瘤的抑制作用

聯(lián)合治療組 (MS-275+DDP)小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制,移植瘤質(zhì)量為(0.96±0.12)g,抑瘤率為66.8%;DDP組移植瘤質(zhì)量為(1.52±0.19)g;MS-275組移植瘤質(zhì)量為(1.65±0.25)g,而對(duì)照組移植瘤質(zhì)量為(2.78±0.28)g。治療組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05),聯(lián)合治療組 (MS-275+DDP)與MS-275組或DDP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。

2.2 H22移植瘤超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡觀察結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞壞死,但部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,常染色質(zhì)豐富;MS-275治療組可見(jiàn)部分早期凋亡細(xì)胞;順鉑組可見(jiàn)細(xì)胞大量壞死,未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡指征;MS-275+順鉑聯(lián)合治療組可見(jiàn)凋亡小體,細(xì)胞質(zhì)密度增高,染色質(zhì)高度凝集固縮。

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

用免疫組化SP法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織Caspase-3及VEGF蛋白表達(dá)水平,其中細(xì)胞漿著色成棕黃色為陽(yáng)性表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各治療組與對(duì)照組比較及聯(lián)合治療組與單獨(dú)應(yīng)用順鉑或MS-275治療組比較,Caspase-3蛋白表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05);另外,各治療組與對(duì)照組比較,VEGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào),且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)。用CD31標(biāo)記微血管密度 (MVD)的表達(dá)顯示,治療組與對(duì)照組比較及聯(lián)合治療組與單獨(dú)應(yīng)用順鉑或MS-275治療組比較,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)。

表1 各組Caspase、VEG F、CD31(MVD)蛋白表達(dá)水平 %

3 討 論

肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,其發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異的積累過(guò)程。肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展不僅存在細(xì)胞增殖與分化的異常,也與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)[3]。MS-275是一種較新的苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑 (HDACIs),有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖阻滯、分化凋亡以及選擇性地作用腫瘤細(xì)胞等抗癌活性。據(jù)報(bào)道[4-5],MS-275已被證實(shí)對(duì)白血病和實(shí)體瘤進(jìn)行治療,表現(xiàn)出良好的療效,不良反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生程度均極低,這說(shuō)明與傳統(tǒng)的化療藥物相比HDACIs具有較大的優(yōu)勢(shì)。本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中證明MS-275在肝癌細(xì)胞系Hep3B中能誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1表達(dá),加速腫瘤細(xì)胞凋亡[6],并對(duì)多個(gè)小鼠的人腫瘤模型上都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑瘤作用。Sato等[7]應(yīng)用MS-275聯(lián)合順鉑治療口腔鱗狀細(xì)胞癌,證實(shí)兩類藥物可通過(guò)不同途徑作用于腫瘤細(xì)胞,具有協(xié)同作用,對(duì)化療藥物起到減毒增效的功效。研究表明[8],肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞凋亡與腫瘤的新生血管生成程度密切相關(guān),血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中具有重要意義。腫瘤內(nèi)血管生成受多種相關(guān)基因/蛋白的調(diào)控,它們共同調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的生物學(xué)行為,其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生成因子在腫瘤血管生成中發(fā)揮主要作用。VEGF是由腫瘤細(xì)胞分泌,通過(guò)與血管內(nèi)皮上的相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,同時(shí)可增加血管通透性使內(nèi)皮細(xì)胞遷移,誘導(dǎo)腫瘤血管生成,維持腫瘤的繼續(xù)生長(zhǎng),是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管生成因子,與諸多生理及病理過(guò)程有關(guān)。而微血管密度被認(rèn)為是能反映腫瘤血管生成的一個(gè)指標(biāo),能反映干細(xì)胞癌的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力,且與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān),被認(rèn)為是一種新的腫瘤生物學(xué)特征[9]。故針對(duì)癌細(xì)胞凋亡或抑制癌內(nèi)新生血管形成的治療將成為抑制肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)的熱點(diǎn)。

肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中微環(huán)境的改變可以影響腫瘤細(xì)胞的凋亡狀態(tài),是通過(guò)激活一系列基因、啟動(dòng)各種機(jī)制而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,其中Caspase蛋白起著極其重要的作用[10]。本研究通過(guò)在小鼠體內(nèi)移植肝細(xì)胞癌,并分別采用化療藥物順鉑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275及聯(lián)合用藥 (DDP+MS-275)等方法進(jìn)行治療,結(jié)果顯示,聯(lián)合治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制,移植瘤質(zhì)量為(0.96±0.12)g,抑瘤率達(dá)到66.8%,與順鉑治療組和MS-275治療組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明化療藥物順鉑和MS-275聯(lián)合應(yīng)用在抑制干細(xì)胞癌瘤體生長(zhǎng)和增加抑瘤率中都發(fā)揮明顯療效,明顯抑制干細(xì)胞癌的增殖生長(zhǎng),起到明顯的協(xié)同效應(yīng)。在使用透射電鏡觀察移植瘤超微結(jié)構(gòu)來(lái)看,聯(lián)合治療組可見(jiàn)凋亡小體,細(xì)胞質(zhì)密度增高,染色質(zhì)高度凝集固縮,相比于單獨(dú)使用順鉑組或MS-275組而言,凋亡特征非常明顯。用免疫組化SP法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組中Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào),推測(cè)聯(lián)合應(yīng)用順鉑和MS-275治療肝細(xì)胞癌移植瘤過(guò)程中,通過(guò)不同途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并發(fā)揮協(xié)同作用可能是實(shí)現(xiàn)其對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制之一。

肝細(xì)胞癌是惡性腫瘤,侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是其主要生物學(xué)特征,也是影響肝細(xì)胞癌患者治療效果和預(yù)后的重要因素,而肝細(xì)胞癌內(nèi)新生血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中具有重要意義。本研究用免疫組化SP法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織VEGF蛋白表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各治療組與對(duì)照組比較,VEGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào),且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外,用CD31標(biāo)記微血管密度 (MVD)的表達(dá)顯示,治療組與對(duì)照組比較及聯(lián)合治療組與單獨(dú)應(yīng)用順鉑或MS-275治療組比較,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)。本研究結(jié)果說(shuō)明,聯(lián)合治療組可通過(guò)明顯下調(diào)VEGF蛋白表達(dá),減少腫瘤細(xì)胞MVD,對(duì)小鼠移植肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有顯著抑制作用。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究,聯(lián)合應(yīng)用MS-275及化療藥物順鉑治療小鼠肝細(xì)胞癌移植瘤,可能通過(guò)不同途徑及機(jī)制作用于肝癌細(xì)胞,加速腫瘤細(xì)胞凋亡,并抑制腫瘤內(nèi)新生血管形成,控制肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,為肝細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)和全新的聯(lián)合用藥方案。

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