羊骨降血壓肽制備工藝的研究

馮雅蓉,馬儷珍

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院,山西太谷 030801;2.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300000)

高血壓是影響人類健康最常見的慢性非傳染性疾病,同時也是誘發(fā)冠心病、心腎功能衰竭的最重要因素,因此被稱為“無聲殺手”[1]。由于目前合成降壓藥的副作用逐漸引起人們的重視,而食源性降血壓成分可以安全用于保健品及藥物的生產(chǎn),并且在體內(nèi)仍能發(fā)揮一定的降血壓作用,因此食源降壓成分的開發(fā)備受關(guān)注。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)在人體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要作用[2],它的制備可以為食品和醫(yī)藥工業(yè)提供新資源,也可以為蛋白質(zhì)的深層次利用另劈捷徑,必將有廣闊的應(yīng)用前景。而且天然蛋白來源的生物活性肽與相應(yīng)的合成物相比,作用條件溫和,安全性高,具有較強的穩(wěn)定性,因而可以作為功能因子添加到食品中,起到相應(yīng)的保健功效。目前關(guān)于乳蛋白源降血壓肽、魚蛋白源降血壓肽、大豆蛋白源降血壓肽等有各種文獻報道[3～5],但以羊骨為原料,以降血壓活性為考察指標,優(yōu)選最佳用酶種類和酶解條件國內(nèi)外未見報道。本實驗的目的是從羊骨中獲得降血壓活性較強的酶解工藝參數(shù),以期為羊骨的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 原料

羊骨,由天津中敖食品集團有限公司提供。

1.2 蛋白酶

中性蛋白酶(20萬U?g-1),堿性蛋白酶(20萬U?g-1),木瓜蛋白酶(65萬U?g-1),胃蛋白酶(1.25萬 U?g-1),酸性蛋白酶(8.0萬 U?g-1);胰蛋白酶(2.5 g?kg-1);動物蛋白水解酶(2.5 g?kg-1),均由天津市諾奧酶制劑公司提供。

1.3 主要試劑

ACE,HHL,美國 Sigma 公司;HCl、NaOH 、硼酸鈉、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.4 試驗設(shè)備

PHS-3B型酸度計(上海理達儀器廠);SHA-C型恒溫振蕩器(常州國華電子儀器有限公司);TDL-5型臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);JT3101N型電子天秤(上海精密實驗設(shè)備有限公司);FD-1C冷凍干燥機(北京博醫(yī)實驗儀器有限公司);SW-CJ-1FD型單人單面潔凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);Finnpipette移液器(5μ L～1000μ L)熱電(上海儀器有限公司)。

1.5 試驗方法

1.5.1 羊骨酶解工藝

新鮮羊骨→清洗→高壓蒸煮→烘干→粉碎→加酶水解→滅酶→離心→上清液→冷凍干燥→酶解物混合粉→測定

具體方法參考劉玉花,馬儷珍等人的方法[6]。

1.5.2 酶的優(yōu)選

運用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、動物蛋白水解酶和酸性蛋白酶對羊骨粉進行水解,其酶解條件見表1。

表1 七種蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolyze condition of seven proteases

1.6 ACE抑制率的體外測定方法

測定ACE抑制肽活性的方法普遍使用的是修改自Cushman和Cheung(1971)[7]的實驗方法和朱迎春等人的研究方法[8]。

1.7 中性蛋白酶水解條件優(yōu)化方案

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,適應(yīng)于羊骨酶解降血壓多肽的酶種類是中性蛋白酶,為選擇中性蛋白酶的最佳酶解條件,試驗中性蛋白酶的酶濃度、底物濃度、pH、溫度和水解時間為五因子,采用五因子二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計試驗,對羊骨的水解條件進行優(yōu)化,優(yōu)選降血壓活性較高的羊骨酶解條件,中性蛋白酶編碼值如表2所示。

表2 中性蛋白酶酶解羊骨編碼值表Table 2 The level coding of Neutrase factors

2 結(jié)果與討論

2.1 七種酶單因素試驗的結(jié)果

按照表1的試驗條件酶解羊骨粉,以降血壓活性ACE抑制率為考察指標,試驗結(jié)果見表3。

從表3可以看出,在這七種蛋白酶中,動物蛋白酶和酸性蛋白酶的的ACE抑制率分別為125%和-20%,屬非正常范圍,應(yīng)予以排除。而中性蛋白酶的ACE抑制率最高(66.0%),胃蛋白酶和胰蛋白酶的ACE抑制率相對中性蛋白酶來說較低,所以選用中性蛋白酶做下一步試驗的最佳用酶。

2.2 中性蛋白酶最佳條件的優(yōu)選結(jié)果

五因子二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計試驗的結(jié)果見表4所示。

表3 七種酶篩選結(jié)果Table 3 The result of seven proteases

表4 五因子二次正交旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計結(jié)果Table 4 The result of five factors quadratic unversal rotational design

根據(jù)設(shè)計原理,特征根全為負,有最小值;特征根全為正,有最大值;本試驗對回歸方程進行主成分分析,得到五個特征根,這五個特征根四正一負?？梢曰菊业浇笛獕旱淖畲笾?中性蛋白酶添加濃度(X1)203.14 U?g-1,底物質(zhì)量濃度(X2)1∶2.5,pH 值(X3)7.0;溫度(X4)50.20℃,酶作用時間(X5)8 h 2 min。

而從表4中,第13號和第18號的降血壓活性比較高,均達到92.31%,第13號的酶解條件為:中性蛋白酶添加濃度(X1)150 U?g-1,底物質(zhì)量濃度(X2)1∶2,pH 值(X3)7.0;溫度(X4)55 ℃,酶作用時間(X5)7 h。第18號的酶解條件為:中性蛋白酶添加濃度(X1)100 U?g-1,底物質(zhì)量濃度(X2)1∶3,pH 值(X3)7.0;溫度(X4)50 ℃,酶作用時間(X5)6 h。

2.3 驗證試驗

將前面優(yōu)選的試驗結(jié)果和第13號以及第18號分別再酶解3次,測定其ACE抑制率,取其平均值,結(jié)果見表5。從表5可以看出,第13號和第18號的酶解條件所得到的羊骨酶解物,其降血壓活性要好于優(yōu)選的酶解條件,以第18號酶解條件所測定的ACE抑制率最高。

蛋白質(zhì)的酶法水解現(xiàn)在是水解蛋白質(zhì)使用最多的一種方法,因為它反應(yīng)溫度低,條件溫和,時間短,對蛋白質(zhì)本身的影響不大,不會對后續(xù)研究產(chǎn)生不良影響。但是,在酶解過程中,不同的條件所得的產(chǎn)物也會不同,雖然差別很小,但是其作用有可能千差萬別。通過試驗數(shù)據(jù)可以看出,不同的條件,所得產(chǎn)物的ACE抑制率也有很大的差別。這點與許多研究報道相符[5,9～12]。從分析軟件所得的最優(yōu)組合與抑制率最高的13號、18號進行對比時發(fā)現(xiàn),最優(yōu)組合的ACE抑制率沒有13號和18號的抑制率高,其原因還有待進一步分析。

表5 ACE抑制率的比較Table 5 The compare of ACE suppression rate

3 結(jié)論

本試驗說明,以羊骨為原料,欲獲得降血壓活性較強的酶解物,中性蛋白酶是比較適宜用酶,其ACE抑制率最高,達66.0%,酶解條件為:酶濃度為100 U ?g-1、底物濃度為25%、pH 值7.0、溫度為50℃、時間6 h。

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