3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚抑菌活性的研究

關(guān)曄晴,陳紅兵,張寶俊,韓巨才,劉慧平

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院,山西 太谷030801)

化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用,給人類(lèi)健康及環(huán)境安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅,隨之而來(lái)的抗藥性問(wèn)題也日漸突出。從微生物中尋找發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物,是生物農(nóng)藥研制的重要途徑[1～3]。放線菌是一類(lèi)重要的微生物資源,目前從微生物中分離的抗生素類(lèi)物質(zhì)有60%以上來(lái)源于放線菌的代謝產(chǎn)物[4～7],如春雷霉素、公主嶺霉素、波拉霉素、武夷菌素、中生霉素、多抗菌素等[8],其中部分抗生素已得到開(kāi)發(fā),并在生產(chǎn)實(shí)踐中取得了良好的防治效果。本試驗(yàn)前期從1株辣椒內(nèi)生婁徹氏鏈霉菌(Streptomyces rochei)中分離到1種化合物3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚[9,10],目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于該物質(zhì)對(duì)植物病原真菌拮抗活性方面的研究較少,本研究以3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚為研究對(duì)象,測(cè)定了其對(duì)6種常見(jiàn)植物病原真菌的抑制作用,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,將其開(kāi)發(fā)成為生物農(nóng)藥新品種提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂20 g,H2O 1000 mL。

1.1.2 供試病原菌

番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥葉枯病菌(Alternaria triticina)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinf ectum)、梨黑斑病菌(Alternaria alternata),以上病菌均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)化保實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 供試藥劑

3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚(本實(shí)驗(yàn)室合成)、丙酮(天津市化學(xué)試劑六廠)、Tween80(天津市北辰方正試劑廠)、75%WP甲基托布津(日本曹達(dá)株式會(huì)研制)、50%WP多菌靈(海南江河農(nóng)藥化工有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)6種病菌菌絲抑制作用的測(cè)定

采用FAO推薦的菌落直徑法[11]。將3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮溶解,分別用無(wú)菌水稀釋到100,200,400,800,1600 mg?L-15個(gè)濃度,將各濃度藥液分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混合制備含藥平板。分別接入直徑5 mm的供試6種病原菌新鮮菌塊,在25℃條件下培養(yǎng)5 d后,測(cè)定不同濃度下各處理的菌落直徑,重復(fù)3次,以含體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮為對(duì)照。用DPS6.0軟件分析毒力回歸方程式、EC50值和95%置信限。

1.2.2 對(duì)6種病菌孢子抑制作用的測(cè)定

對(duì)病原菌孢子萌發(fā)抑制作用采用懸滴法[12]。制備孢子懸浮液,將3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚配制成50,100,200,400,800 mg?L-15個(gè)濃度溶液,分別與等體積的孢子懸浮液混合,保濕培養(yǎng)12、24 h后,在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況。以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑1/2計(jì)為萌發(fā),重復(fù)5次,以無(wú)菌水為對(duì)照。

1.2.3 與2種殺菌劑毒力差異的測(cè)定

分別將75%WP甲基托布津、50%WP多菌靈制備濃度為10 000 mg?L-1的母液,再根據(jù)預(yù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果將各藥劑分別用無(wú)菌水稀釋為1.2.2述5個(gè)不同的濃度藥液,將各濃度藥液分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混合制備含藥平板。分別接入直徑為5 mm的新鮮病菌菌塊,在25℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d后,測(cè)定不同濃度下各處理的菌落直徑,重復(fù)3次,以無(wú)菌水為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

測(cè)定結(jié)果如表1所示:3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚對(duì)6種病原菌菌絲的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用,其 EC50在 186.48～711.78 mg?L-1之間,其中對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最強(qiáng),其EC50為186.48 mg?L-1,對(duì)番茄早疫病菌的抑制作用次之,EC50為202.29 mg?L-1;再次為對(duì)小麥赤霉和辣椒枯萎病菌的抑菌作用,EC50分別為372.56和468.33 mg?L-1;對(duì)小麥葉枯和梨黑斑病菌的抑制作用最弱,EC50分別為 627.78和 711.78 mg?L-1;表明3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚的抗菌譜較廣,但對(duì)不同病原菌的抑菌活性可能存在一定差異。

表1 對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Table 1 The effect on mycelial growth of six kinds of pathogens

2.2 對(duì)6種病原菌孢子萌發(fā)的影響

測(cè)定結(jié)果如表2所示:3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚對(duì)所測(cè)6種病原菌孢子的萌發(fā)均有一定的抑制作用,對(duì)番茄灰霉、梨黑斑和番茄早疫病菌的抑制作用較強(qiáng),EC50分別為 171.93、173.74和183.91 mg?L-1,其次為小麥葉枯和辣椒枯萎病菌,EC50分別為 204.12和 205.34 mg?L-1,對(duì)小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用最弱,其EC50為337.85 mg?L-1。研究結(jié)果表明,3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于對(duì)病菌菌絲的抑制作用,但抑制強(qiáng)弱與對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用有所不同。

2.3 與2種殺菌劑的毒力差異比較結(jié)果

測(cè)定結(jié)果如表3所示:3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚對(duì)番茄早疫病菌和梨黑斑病菌的EC50分別為202.29和711.78 mg?L-1;甲基托布津?qū)煞N病菌的EC50分別為58.89和47.04 mg?L-1;多菌靈對(duì)兩種病菌的 EC50分別為 643.38和1208.87 mg?L-1;與甲基托布津相比,該物質(zhì)對(duì)兩種病菌的EC50較高;而與多菌靈相比,該物質(zhì)對(duì)兩種病菌的EC50明顯小于多菌靈,存在顯著性差異。說(shuō)明3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚對(duì)以上2種病菌的抑菌效果優(yōu)于殺菌劑多菌靈,有一定的實(shí)用價(jià)值。

表2 對(duì)6種病原菌孢子萌發(fā)的影響Table 2 The effect on spore germination of six kinds of pathogens

表3 與2種殺菌劑的毒力差異的比較Table 3 The comparison of virulence differences with two fungicides

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明:3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚對(duì)番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、小麥葉枯病菌、梨黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用,表明該物質(zhì)的抗菌譜較廣,但針對(duì)不同病原菌,其抑制效果可能存在差異,如對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng),EC50為186.48 mg?L-1,對(duì)梨黑斑病菌的抑制作用最弱,EC50為711.78 mg?L-1,這可能與不同病原菌的形態(tài)差異、生理生化特性等有一定的相關(guān)性。同時(shí),該物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用亦最強(qiáng),表明該物質(zhì)對(duì)番茄灰霉病菌有一定的實(shí)用價(jià)值。與常用殺菌劑相比,該物質(zhì)對(duì)部分病原菌的抑菌活性優(yōu)于廣譜性殺菌劑-多菌靈的抑菌活性,表明3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為生物農(nóng)藥的應(yīng)用價(jià)值。

3,5-二叔丁基-4羥基-芐基甲醚是在試驗(yàn)組前期從1株辣椒內(nèi)生婁徹氏鏈霉菌代謝產(chǎn)物中分離得到的一種化合物,婁徹氏鏈霉菌僅在醫(yī)藥[13]方面的應(yīng)用有所報(bào)道,代謝產(chǎn)物在抗真菌活性方面還未查到有文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)測(cè)定了該物質(zhì)對(duì)6種常見(jiàn)植物病原菌的抑制作用,雖然試驗(yàn)中測(cè)定的EC50高于廣譜性殺菌劑甲基托布津,但其為微生物分泌的代謝產(chǎn)物,該物質(zhì)可能與環(huán)境有很好的相容性,而且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性,因此具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。下一步將通過(guò)對(duì)該化合物進(jìn)行基團(tuán)改造,力爭(zhēng)提高該化合物的殺菌效果。同時(shí),本試驗(yàn)僅在室內(nèi)通過(guò)生物測(cè)定的方法分析了該物質(zhì)的抑菌活性,關(guān)于其在田間防效的研究正在進(jìn)行中。

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