高效液相柱前衍生法測(cè)定板藍(lán)根膠囊中精氨酸的含量

河北龍海藥業(yè)有限公司 王國(guó)振 王 煥 陸 欣 （石家莊 052165）

板藍(lán)根膠囊是有板藍(lán)根片改劑型而來(lái),是由板藍(lán)根藥材組成,具有清熱解毒,涼血利咽功效。用于肺胃熱盛所致的咽喉腫痛、口咽干燥。為了進(jìn)一步控制其質(zhì)量,采用高效液相色譜法對(duì)制劑中精氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000高效液相色譜儀 （戴安公司）;板藍(lán)根膠囊 （規(guī)格:0.27 g/粒,河北龍海藥業(yè)有限公司提供,批號(hào)091001、091002、091003）、精氨酸對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):872-200204）;乙腈為色譜純,其他試劑為分析純。

2 色譜條件篩選

色譜柱:Diamonsil C 18（5μm,150×4.6mm,迪馬公司）;流速:1.0 mL/min、進(jìn)樣量:20μL檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;流動(dòng)相:醋酸鈉緩沖液 （取無(wú)水醋酸鈉 4.1 g,加 N,N-二甲基甲酰胺 50m L,加水稀釋至 1 000mL,用乙酸調(diào)節(jié) pH至 6.1）-乙腈 （85︰ 15）。[1]

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 稱(chēng)取精氨酸對(duì)照品適量,加水制成一定濃度的溶液,衍生化后置 SP-756PC型紫外分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司）下,繪制精氨酸紫外吸收?qǐng)D譜,精氨酸在 360 nm左右的波長(zhǎng)處有最大吸收。

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備[2]:精密稱(chēng)取精氨酸對(duì)照品適量,加水制成每 1mL含 0.1mg的溶液,精密量取 1m L,置 10m L棕色量瓶中,加 0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液 1m L,1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液 1mL,搖勻,避光于 60℃水浴中加熱 30 min,取出,放冷,用磷酸鹽緩沖液 （pH 7.0）稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜 （0.45μm）濾過(guò),即得。

2.2.2 供試品溶液的制備[2]:取樣品約 0.2 g,精密稱(chēng)定,精密加水 25mL,振搖 20min,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液1m L,置10mL棕色量瓶中,加0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液1.0m L,1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液 1.0m L,搖勻,避光于 60℃水浴中加熱 30 min,取出,放冷,用磷酸鹽緩沖液 （pH 7.0）稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜 （0.45μm）濾過(guò),取續(xù)濾液及時(shí)進(jìn)樣。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備:取缺板藍(lán)根的板藍(lán)根膠囊陰性對(duì)照品相同量,按供試品溶液的制備方法操作制備陰性對(duì)照溶液。

按上述項(xiàng)下色譜條件,精密吸取空白溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各 20μL,分別注入高效液相色譜儀。

2.2.4 結(jié)果:供試品色譜中,在與精氨酸對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上有一相同的保留峰,而缺板藍(lán)根的陰性對(duì)照品,在與精氨酸對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上無(wú)成分峰出現(xiàn)。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液 20μL,分別注入高效液相色譜儀。其分析結(jié)果精氨酸峰的理論塔板數(shù)在 2 000以上,各雜質(zhì)峰與主峰的分離度均大于 1.5,因此規(guī)定理論塔板數(shù)按精氨酸峰計(jì)應(yīng)大于 2 000。

3 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為 0.208mg/mL的精氨酸對(duì)照品溶液,分別制成 4.992×10-3、 2.496×10-2、 0.124 8、 0.166 4和0.208mg/mL的對(duì)照品溶液,再分別精密量取 1.0mL,置10mL棕色量瓶中,加 0.5 mol/L的碳酸氫鈉溶液 1.0 mL,1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液 1.0 m L,搖勻,避光于60℃水浴中加熱 30m in,取出,放冷,用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜 （0.45μm）濾過(guò),即得。分別精密量吸取上述對(duì)照品溶液各 20μL,在上述色譜條件下,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo),以峰面積值為縱坐標(biāo)作圖,得到:精氨酸回歸方程為:Y=11 721 559.06 X-4 242.5,r=0.999 9。

以上結(jié)果表明:在 9.984×10-2～4.16μg范圍內(nèi),精氨酸進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系,實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,正文中對(duì)樣品的測(cè)定采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算精氨酸的含量。

4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一批次的樣品內(nèi)容物,按供試品下方法制得,在 8 h內(nèi)第 0、2、4、 6、 8 h進(jìn)樣測(cè)定 1次,記錄色譜圖。結(jié)果表明樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定,RSD為 1.8%。

5 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣 6次,記錄色譜圖。結(jié)果表明精密度的良好,RSD為 1.0%。

6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份,分別按供試品下制備的方法操作,按擬定的色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果表明本方法有良好的重復(fù)性,RSD為 1.6%。

7 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品 0.1 g,平行 9份,分別加入80%、100%及 120%對(duì)照品的精氨酸的量,照 “供試品溶液制備”項(xiàng)下操作,測(cè)定,記錄色譜圖,并計(jì)算平均回收率。平均回收率 99.7%,RSD=1.50%。結(jié)果表明,本方法有很高的準(zhǔn)確度。詳見(jiàn)表1。

8 三批樣品含量測(cè)定

分別取 3批板藍(lán)根膠囊內(nèi)容物適量,按供試品溶液制備方法制得后,在上述色譜條件下測(cè)定,測(cè)得 3批樣品中精氨酸的平均含量分別為 2.24mg/粒、2.63 mg/粒、2.35 mg/粒。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （μg,%）

9 討論

板藍(lán)根膠囊為我公司獨(dú)家產(chǎn)品,首次以HPLC柱前衍生方法分析了板藍(lán)根膠囊中精氨酸的含量。該方法操作簡(jiǎn)單,重現(xiàn)性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。板藍(lán)根顆粒雖也是有單味藥材板藍(lán)根組成,但含有的輔料不同,對(duì)采用 HPLC柱前衍生方法分析時(shí),結(jié)果差異較大,特別是不同廠家板藍(lán)根顆粒采用 HPLC柱前衍生方法分析時(shí),對(duì)結(jié)果影響很大,在以后實(shí)驗(yàn)中有待考察。

[1] 陳矛,曾令杰.板藍(lán)根顆粒中精氨酸的柱前衍生化HPLC測(cè)定 [J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2003,17（5）:42-44

[2] 周海嬰.RP-HPLC柱前衍生法測(cè)定復(fù)方甘草酸銨S分散片的含量 [J].吉林醫(yī)學(xué),2009,30（12）:28-30

（2011-05-06 收稿）