高效液相法測定琦紅丸中酸式及內(nèi)酯洛伐他汀含量

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(1.吉林省生物研究所，吉林 長春 130012；2.長春金賽藥業(yè)股份有限公司，吉林 長春 130012)

琦紅丸是吉林省生物研究所開發(fā)的由功能性紅曲、荷葉、黑木耳等制成的具有降血脂作用的保健食品，功能性紅曲所含有的洛伐他汀是體內(nèi)膽固醇合成酶Hmg-COA還原酶的專一性抑制劑，能夠有效減少或阻斷內(nèi)源性膽固醇的合成，達到降血脂作用。其存在形式分酸式和內(nèi)酯2種,酸式結(jié)構(gòu)的洛伐他汀空間結(jié)構(gòu)與體內(nèi)Hmg-COA更為接近，無需水解，其活性較內(nèi)酯式高約一倍。而內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的洛伐他汀本身無生物活性，但在人體內(nèi)可以被水解成酸式結(jié)構(gòu)而具有活性。有關(guān)文獻[1-3]對洛伐他汀含量測定報道只測定內(nèi)酯洛伐他汀，鑒于洛伐他汀在功能性紅曲米中的存在特點,本文采用酸式和內(nèi)酯2種形式的洛伐他汀含量之和作為制定琦紅丸中洛伐他汀含量測定標準的依據(jù)，更為合理、科學(xué)，能夠較好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試劑

安捷倫1100高效液相色譜儀，安捷倫自動進樣器，低速離心機，超聲波清洗器；甲醇為色譜純，無水乙醇、磷酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純；洛伐他汀(內(nèi)酯)標準品(批號：100600-200502,供含量測定用)購自中國藥品生物制品鑒定所，規(guī)格:100 mg；琦紅丸樣品由吉林省生物研究所提供。

2 適應(yīng)性試驗

色譜柱：XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶0.12%磷酸溶液(V/V)=77∶23；柱溫：24 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長238 nm；進樣量：20 μL。規(guī)定其理論塔板數(shù)按洛伐他汀(內(nèi)酯)峰面積計算，應(yīng)不低于2 000。

3 洛伐他汀標準品溶液制備

精密稱取洛伐他汀(內(nèi)酯)標準品40.0 mg，以75%乙醇定容100 mL。此溶液濃度為400 μg/mL。

4 操作方法

4.1 洛伐他汀(內(nèi)酯)標準工作液制備 準確量取洛伐他汀標準品溶液1 mL，以75%乙醇定容至10 mL。此溶液濃度為40 μg/mL。

4.2 供試品溶液制備 取20袋琦紅丸，粉成細粉，混勻，取粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入30 mL 75%乙醇(體積分數(shù))，室溫下超聲50 min，加75%乙醇至接近刻度,再超聲10 min，之后冷卻至室溫，用75%乙醇定容至50 mL，混勻。以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待用。

4.3 定性用酸式洛伐他汀的制備 稱取洛伐他汀(內(nèi)酯)標準品4 mg，以0.2 mol/L氫氧化鈉溶液定容至100 mL，在50 ℃條件下超聲轉(zhuǎn)化1 h，放置到室溫后再放置1 h。

4.4 供試品中洛伐他汀含量測定 取洛伐他汀內(nèi)酯標準工作液、洛伐他汀酸式對照品溶液、供試品溶液各20 μL分別注入高效液相色譜儀，以供試品中洛伐他汀酸式峰面積與內(nèi)酯峰面積之和與洛伐他汀內(nèi)酯標準品峰面積之比計算琦紅丸中洛伐他汀的含量。洛伐他汀(內(nèi)酯)色譜圖見圖1；洛伐他汀(酸式)色譜圖見圖2；供試品色譜圖見圖3。

圖1 洛伐他汀(內(nèi)酯)標準品色譜圖

圖2 洛伐他汀(酸式)標準品色譜圖

圖3 琦紅丸供試品色譜圖

5 方法學(xué)考察

5.1 標準曲線的制備 分別精密吸取洛伐他汀標準品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL置10 mL容量瓶中，加75%乙醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，分別注入液相色譜儀。測定峰面積，以峰面積為縱坐標，以洛伐他汀(內(nèi)酯)含量為橫坐標，繪制標準曲線。測得回歸方程為Y=67.471 14X-8.914 04(r=0.999 9)。結(jié)果表明洛伐他汀(內(nèi)酯)在8.44～253.2 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

5.2 空白試驗 取不含功能性紅曲的陰性對照樣品，按上述方法檢測，結(jié)果陰性對照色譜中，在洛伐他汀酸式與內(nèi)酯的保留時間處，無干擾峰出現(xiàn)。

5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液20 μL，分別在0、2、4、6、8、10 h照上述方法測定，以洛伐他汀酸式與內(nèi)酯峰面積之和計，結(jié)果表明供試品在10 h內(nèi)，未發(fā)生明顯變化。峰面積的RSD值為0.23%。

5.4 精密度試驗 取同一標準品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積值，結(jié)果，RSD=0.11%。

5.5 重復(fù)性試驗 取同一批號供試品(批號：20100801)6分，按4.2項下方法制備供試品溶液，分別按上述方法測定含量，結(jié)果RSD=0.47%。

5.6 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(批號：20100801)6分，分別加入等量的內(nèi)酯洛伐他汀標準品。按照上述方法進行測定，計算出回收率，測定結(jié)果平均回收率=99.25%，RSD=1.42%。

5.7 3批樣品的含量測定 批號20100801、20100802、20100803的含量(mg/100 g)分別為350、349、352。

6 結(jié)論

通過比較紅曲原料、按配方比例混合的樣品及生產(chǎn)的3批樣品含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)過程酸式洛伐他汀部分脫水轉(zhuǎn)成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，而且洛伐他汀含量有少量下降現(xiàn)象，可能是生產(chǎn)過程中受熱所造成的，但不影響產(chǎn)品質(zhì)量及功效?？傊?，本方法操作簡便，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，用于琦紅丸中洛伐他汀的含量測定，能夠很好的控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

[1]廖一民,向世學(xué).高效液相同時測定保健食品中兩種結(jié)果形式洛伐他汀的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(3):286-287.

[2]宋洪濤.HPLC法對不同來源紅曲中洛伐他汀的定量分析[J].中草藥,1999,30(2):49.

[3]文鏡,常平.紅曲中內(nèi)酯型Lovastatin的HPLC測定方法研究[J].食品科學(xué),2000(12):56.