中間偃麥草和長(zhǎng)穗偃麥草染色體核型分析

張曉燕，毛培春，孟 林，張德罡

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097)

偃麥草屬(Elytrigia)系禾本科多年生疏叢根莖型禾草，是一類重要的優(yōu)良牧草資源和水土保持、固土護(hù)坡等生態(tài)環(huán)境建設(shè)的首選植物[1]，全世界約有50 種, 我國(guó)野生分布有6種[2]。其中，中間偃麥草(E.intermedia)和長(zhǎng)穗偃麥草(E.elongata)是研究較為系統(tǒng)、應(yīng)用較為普遍的2個(gè)偃麥草屬植物，具有抗旱、耐寒、耐鹽堿等特性，并作為小麥(Triticumaestivum)野生近緣種，是小麥外源基因資源庫(kù)的備用植物資源之一。它們攜帶有重要的抗病基因，如對(duì)小麥銹病、小麥黃矮病、赤霉病和白粉病等多種小麥病害具明顯抗性的抗病基因，此外，還具有大穗、多花以及極強(qiáng)的抗低磷營(yíng)養(yǎng)脅迫能力等許多優(yōu)良性狀基因[3]，成為小麥外源基因轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)緣雜交育種的優(yōu)良資源，被廣泛應(yīng)用于小麥新品種選育中[4]。同時(shí)，針對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)解剖[2,5]、光合特性[6]、抗旱耐鹽堿特性[7-10]、染色體組構(gòu)成[11]和特異分子標(biāo)記[12]等方面也有一定研究。本研究主要對(duì)從國(guó)外引進(jìn)的中間偃麥草和長(zhǎng)穗偃麥草的染色體核型進(jìn)行分析，旨為對(duì)其深度開發(fā)利用提供遺傳細(xì)胞學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 研究材料由美國(guó)國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)提供的中間偃麥草(原產(chǎn)于烏克蘭)和長(zhǎng)穗偃麥草(原產(chǎn)于葡萄牙)的種子。

1.2試驗(yàn)方法 選取飽滿的種子放在經(jīng)水浸濕的鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。待種子根長(zhǎng)為1 cm左右，于08：00-10：00，切下長(zhǎng)約0.5 cm的根尖，經(jīng)8-羥基喹啉(0.002 mol/L)處理2～4 h。然后用卡諾固定液[無(wú)水酒精∶冰醋酸=3∶1(V∶V)]固定2～4 h，1.0 mol/L鹽酸60℃水浴條件下解離5～10 min。將根尖放在載玻片上，切下頂端1～2 mm，滴加石炭酸品紅染液進(jìn)行染色，10 min左右即可壓片。

在顯微鏡下觀察并尋找染色體輪廓清晰、染色適中、分散而不重疊的分裂中期相，利用LY-WN萬(wàn)能視頻成像裝置(成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司生產(chǎn))讀取視頻顯微圖像，KARIO自動(dòng)核型分析軟件(成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司生產(chǎn))進(jìn)行核型分析。

鏡檢后，取3～5個(gè)細(xì)胞的染色體，用顯微尺量出每條染色體的長(zhǎng)臂值、短臂值，制成染色體參數(shù)表格和核型模式圖。核型不對(duì)稱系數(shù)按Arano[13]提出的長(zhǎng)臂總長(zhǎng)與全組染色體總長(zhǎng)之比的核型不對(duì)稱系數(shù)(AS.K%)來(lái)確定。核型分類按Stebbins[14]提出的最長(zhǎng)染色體與最短染色體之比及臂比大于2的染色體所占的比例標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。采用Levan等[15]以染色體臂比來(lái)確定著絲點(diǎn)位置和Kuo等[16]以染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)將染色體分成4組的染色體分類標(biāo)準(zhǔn)。用AutoCAD作核型模式圖，圖像處理采用AdobePhotoshop 7.0.1軟件。

2 結(jié)果

2.1中間偃麥草染色體核型分析 中間偃麥草的染色體數(shù)目為2n=6x=42(圖1)。染色體平均長(zhǎng)度2.48 μm，為小染色體。最長(zhǎng)染色體3.98 μm，最短染色體1.23 μm。染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為2.36～7.63，染色體臂比值變化范圍為1.15～2.72，最長(zhǎng)染色體與最短染色體之比為3.24，臂比值>2.0的染色體所占比例為9.52%，屬“2B”核型，核型不對(duì)稱系數(shù)為59%，為基本對(duì)稱型。21對(duì)染色體中有19對(duì)為中著絲粒染色體，2對(duì)為近中著絲粒染色體，未發(fā)現(xiàn)隨體。染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為:10L+10M2+12M1+10S，核型公式為：K(2n)=6x=42=34m+8sm(表1和表2)。

2.2長(zhǎng)穗偃麥草染色體核型分析 長(zhǎng)穗偃麥草的染色體數(shù)目為2n=10x=70(圖2)。染色體平均長(zhǎng)度5.45 μm，為中染色體。最長(zhǎng)染色體7.90 μm，最短染色體3.08 μm。染色體相對(duì)長(zhǎng)度變化范圍為1.62～4.14，染色體臂比值變化范圍為1.01～8.96，最長(zhǎng)染色體與最短染色體之比為2.56，臂比值>2.0的染色體所占比例為34.29%，屬“2B”核型，核型不對(duì)稱系數(shù)為64%，為基本對(duì)稱型。35對(duì)染色體中有19對(duì)為中著絲粒染色體，11對(duì)為近中著絲粒染色體，4對(duì)近端著絲粒染色體，1對(duì)端著絲粒染色體，未發(fā)現(xiàn)隨體。染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為:10L+22M2+30M1+8S，核型公式為：K(2n)=10x=70=38m+22sm+8st+2t(表1和表3)。

圖1 中間偃麥草染色體核型及核型模式圖

表1 中間偃麥草和長(zhǎng)穗偃麥草核型主要特征

表2 中間偃麥草染色體核型參數(shù)

圖2 長(zhǎng)穗偃麥草染色體核型及核型模式圖

3 討論與結(jié)論

3.1偃麥草屬的分類 植物染色體的數(shù)目、形態(tài)等是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一，植物染色體的核型、類型等是表明該種系統(tǒng)演化位置以及和相近種的親緣關(guān)系的重要依據(jù)[17]。1753年，分類大師林奈在他的著作SpciesPlantarum中把偃麥草屬的各個(gè)種均歸于小麥屬的多年生組中。前蘇聯(lián)的Nevski將偃麥草屬?gòu)膫鹘y(tǒng)的冰草屬中分離出來(lái)，并進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、植物地理學(xué)，特別是細(xì)胞核型分析方面提出了偃麥草的進(jìn)化地位，即濱麥草屬(Lymus)→偃麥草屬→冰草屬(Agropyron)[18-19]。

表3 長(zhǎng)穗偃麥草染色體核型參數(shù)

3.2偃麥草種核型比較 據(jù)研究報(bào)道[20]，偃麥草屬植物具有多個(gè)染色體倍性水平，包括二倍體、四倍體、六倍體、八倍體和十倍體，其染色體基數(shù)x=7。本研究表明，試驗(yàn)選用的長(zhǎng)穗偃麥草種質(zhì)系十倍體，其染色體形態(tài)類型較中間偃麥草豐富，且核型不對(duì)稱系數(shù)(64%)略高于中間偃麥草(59%)。根據(jù)Stebbins理論[14]，在生物進(jìn)化過(guò)程中，染色體核型是由對(duì)稱性向非對(duì)稱性演化的。核型對(duì)稱性程度越高的生物，其染色體變異越小，進(jìn)化程度也越低；而非對(duì)稱性程度越高的生物，其染色體變異越大，進(jìn)化程度越高。按照此觀點(diǎn)，在系統(tǒng)演化上，中間偃麥草和長(zhǎng)穗偃麥草均屬于比較原始的種類。

3.3染色體識(shí)別特征 本研究主要采用KARIO自動(dòng)核型分析軟件進(jìn)行核型分析，由于存在有些染色體彎曲、粘連、重疊和變形等的情形，染色體核型圖須在此自動(dòng)分析軟件的基礎(chǔ)上，結(jié)合人工輔助的辦法進(jìn)行校正。準(zhǔn)確地尋找染色體著絲粒位置有利于借助該軟件的顯微尺準(zhǔn)確測(cè)量其染色體長(zhǎng)臂值和短臂值，也是準(zhǔn)確識(shí)別染色體特征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]。同時(shí)，在壓片過(guò)程中，對(duì)材料預(yù)處理的時(shí)間及預(yù)處理劑的選用不同，染色體縮小的程度不同，本研究選用預(yù)處理劑為0.002 mol/L 的8-羥基喹啉，所獲染色體濃縮程度比較好，便于配對(duì)，利于結(jié)果的分析，提高了正確性。

[1]胡志昂,張亞平.中國(guó)動(dòng)植物的遺傳多樣性[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,1997.

[2]史廣東,孟林,毛培春,等.偃麥草屬植物葉片表皮形態(tài)與結(jié)構(gòu)研究[J].草地學(xué)報(bào),2009,17(5):654-664.

[3]呂偉東,徐鵬彬,蒲訓(xùn).偃麥草屬種質(zhì)資源在普通小麥育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀簡(jiǎn)介[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(6):136-140.

[4]王黎明,林小虎,趙逢濤,等.中間偃麥草的染色體組及其優(yōu)良基因向普通小麥的轉(zhuǎn)移[J].中國(guó)草地,2005,27(1):57-63.

[5]史廣東,毛培春,張國(guó)芳,等.中間偃麥草和長(zhǎng)穗偃麥草解剖結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察[J].草業(yè)科學(xué),2009,26(8):52-56.

[6]孟林,毛培春,張國(guó)芳.偃麥草優(yōu)良無(wú)性系及其光合特性日變化規(guī)律研究[J].草業(yè)與畜牧,2006(7):21-24.

[7]孟林,尚春艷,毛培春,等.偃麥草屬植物種質(zhì)材料苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(4):67-74.

[8]孟林,毛培春,張國(guó)芳.偃麥草屬植物種質(zhì)材料不同耐鹽群體生理指標(biāo)分析[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2009,27(4):83-89.

[9]尚春艷,張國(guó)芳,毛培春,等.中間偃麥草苗期NaCl脅迫的生理響應(yīng)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(4):157-162.

[10]馬小廷,米福貴,王毅,等.中間偃麥草、長(zhǎng)穗偃麥草及其雜交種抗旱性評(píng)價(jià)[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(12):92-95.

[11]張學(xué)勇,董玉琛.偃麥草基因組組成及新物種形成規(guī)律的研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999,21:66-67.

[12]尤明山,李保云,唐朝暉,等.偃麥草E染色體組特異RAPD和SCAR標(biāo)記的建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,7(5):1-6.

[13]Arano H.Cytological studies in subfamily Carduoidae (Compositae) of Japan.IX.The karyotype analysis and phytogenic consideration on pertya and Ainsliaea(2)[J].The Botanical Magazine Tokyo,1963,76:32-39.

[14]Stebbins G L.Chromosome Evolution in Higher Plants[M].London:Edward Aronld,1971:88.

[15]Levan A,Fredga K,Sandberg A A.Nomenclacture for centromeric position on chromosomes[J].Hereditas,1964,52:201.

[16]Kuo S R,Wang T T,Huang T C.Karyotype analysis of some formosan gymnosperms[J].Taiwania,1972,17:66.

[17]朱昊.新疆野生偃麥草遺傳多樣性研究[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[18]Barkworth M E.Taxonomy of Triticeae:a historical perspective[J].Hereditas,1992,116:1-14.

[19]Dewey D R.The genomic system of classification as a guide to intergeneric hybridization with the perennial Tritceae[A].In:Gustafson J P.Gene Manipulation in Plant Improvement[M].New York:Plenum Pulishing Corp.,1984：209-279.

[20]李瀟楓.偃麥草屬植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[21]張凱麗,劉輝.一種確定染色體圖象著絲點(diǎn)位置的方法[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào),2001,26(3):110-113.