大鼠恐懼應(yīng)激模型的建立及指標(biāo)篩選

劉佳佳，潘 霄，嚴(yán) 進(jìn)，唐云翔

多種形式的應(yīng)激刺激可引起動(dòng)物行為、認(rèn)知以及機(jī)體多項(xiàng)功能障礙，已引起許多學(xué)者的關(guān)注。恐懼應(yīng)激動(dòng)物模型是模擬人類情感的一種情緒應(yīng)激模型，主要是通過(guò)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物恐懼的創(chuàng)傷應(yīng)激，測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為和生理變化。多項(xiàng)研究表明恐懼應(yīng)激可以直接引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一系列的防御性行為反應(yīng)，包括呆立反應(yīng)、心率增快、驚跳反應(yīng)、逃避反應(yīng)等[1]應(yīng)激反應(yīng)，從而引起神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等微環(huán)境的變化[2]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 64只健康雄性Wisatr大鼠，體重（200±20）g，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食飲水，自然光照，溫度22～26℃。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為恐懼模型組和對(duì)照組，每組32只。

1.2 恐懼模型制作方法

1.2.1 恐懼模型組 大鼠群居飼養(yǎng)于不銹鋼籠中（50 cm×30 cm×20 cm），自由攝食飲水，飼養(yǎng)10 d。第11天放入聲電刺激儀（40 cm×30 cm×20 cm，購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。刺激儀四周為黑色玻璃，底部鋪設(shè)銅柵，可以通1 mA交流電，頂部設(shè)有攝像器及發(fā)聲器，噪音音量分貝固定。前5 min為適應(yīng)期，之后給予2 s（75 Db∶1000 Hz）噪音，并緊跟1 s電流刺激（1 mA），間隔1 min，共30次。第12、13天重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第14天實(shí)驗(yàn)只給予噪音5 min，不予電擊，攝像記錄第6～30 min內(nèi)大鼠行為變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束立即放入自發(fā)活動(dòng)箱內(nèi)，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測(cè)。自第15天起每天于固定時(shí)間重復(fù)第11天實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 對(duì)照組 大鼠于同樣環(huán)境下飼養(yǎng)10 d，第11天放入聲電刺激儀內(nèi)，前5 min為適應(yīng)期，之后只給予2 s（75 Db∶1000 Hz）噪音，無(wú)電擊。 第12、13天重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第14天攝像記錄5 min噪音后6～30 min內(nèi)大鼠行為變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束放入自發(fā)活動(dòng)箱，進(jìn)行應(yīng)激后行為學(xué)檢測(cè)。自第15天起每天于固定時(shí)間重復(fù)第11天實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中抓取動(dòng)物動(dòng)作輕柔，避免不必要的刺激干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 凍結(jié)時(shí)間 凍結(jié)姿勢(shì) （freezing posture）：靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等，期間僅有呼吸和輕微搖擺運(yùn)動(dòng)。其總時(shí)間稱為凍結(jié)時(shí)間（freezing time），即大鼠行為得分。行為評(píng)定采用盲法，單位以秒來(lái)計(jì)算，由3名觀察者觀看錄像后評(píng)分，取其平均值。

1.3.2 體重 自造模成功之后第2天算起分別于1、2、3、4周每周周中 （實(shí)驗(yàn)第18、25、32、39天），對(duì)兩組大鼠體重進(jìn)行測(cè)量，觀察恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠體重的影響。YP系列電子天平（精度0.1 g）購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3.3 自發(fā)活動(dòng) 自造模成功之后第2天算起分別于1、2、3、4周每周周中 （實(shí)驗(yàn)第 18、25、32、39天），進(jìn)行兩組大鼠自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)。測(cè)試大鼠5 min內(nèi)在新異環(huán)境的活動(dòng)情況。自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)（DigBehv-LR）購(gòu)自上海吉量軟件科技有限公司。

1.3.4 血清皮質(zhì)酮含量測(cè)定 自造模成功之后第2天算起分別于1、2、3、4周每周周中（實(shí)驗(yàn)第18、25、32、39天），對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行斷頭取血，全血37℃恒溫靜置30 min后，3 900 r/min離心10 min，取上層血清，送檢。血清皮質(zhì)醇（COP）放射免疫試劑盒購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司并有該公司代測(cè)，檢測(cè)過(guò)程符合各項(xiàng)規(guī)范。

1.3.5 血清C反應(yīng)蛋白含量測(cè)定 自造模成功之后第2天算起分別于1、2、3、4周每周周中（實(shí)驗(yàn)第18、25、32、39天），對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行斷頭取血，全血37℃恒溫靜置30 min后，3 900 r/min離心10 min，取上層血清，送檢。血清高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）放射免疫試劑盒購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司并有該公司代測(cè)，檢測(cè)過(guò)程復(fù)合各項(xiàng)規(guī)范。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；同一對(duì)象不同時(shí)點(diǎn)的計(jì)量資料采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 凍結(jié)時(shí)間 恐懼模型組大鼠在第11天實(shí)驗(yàn)噪音后出現(xiàn)凍結(jié)姿勢(shì)：靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等，期間僅有呼吸和輕微搖擺運(yùn)動(dòng)并伴有立毛、肌肉輕微振頗、大小便失禁等表現(xiàn)。行為評(píng)定采用盲法，凍結(jié)時(shí)間即為大鼠得分，單位以秒來(lái)計(jì)算，由3名觀察者觀看錄像后評(píng)分，取其平均值。三者評(píng)定一致性Kappa值>0.95。兩組間行為學(xué)得分存在顯著性差異，恐懼模型組大鼠行為學(xué)得分高于對(duì)照組 （t=5.700，P<0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 二組行為計(jì)分

2.2 體重 隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增加兩組大鼠體重均有所增長(zhǎng)，但恐懼模型組體重增加較緩。第1周兩組大鼠體重?zé)o顯著差異，第2、3周恐懼模型組體重低于空白對(duì)照組（P<0.05），第4周恐懼模型組體重顯著低于對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠體重（±s，g）

表1 兩組大鼠體重（±s，g）

兩組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

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2.3 自發(fā)活動(dòng)

2.3.1 休息時(shí)間 第1、3、4周，恐懼模型組休息時(shí)間顯著高于對(duì)照組（P<0.05），第2周恐懼模型組休息時(shí)間非常顯著高于對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)表2。

2.3.2 活動(dòng)次數(shù) 第1、4周，恐懼模型組活動(dòng)次數(shù)顯著少于對(duì)照組（P＜0.05）。第2、3周恐懼模型組活動(dòng)次數(shù)非常顯著少于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表2 兩組大鼠自發(fā)活動(dòng)時(shí)休息時(shí)間（±s，s）

表2 兩組大鼠自發(fā)活動(dòng)時(shí)休息時(shí)間（±s，s）

兩組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

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表3 兩組大鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)（±s，次）

表3 兩組大鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)（±s，次）

兩組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

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2.4 皮質(zhì)酮含量 第1、3、4周恐懼模型組血清皮質(zhì)酮高于對(duì)照組（P<0.05），第2周恐懼模型組血清皮質(zhì)酮顯著高于對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)表4。

表4 兩組大鼠血清皮質(zhì)酮水平（±s，μmol/L）

表4 兩組大鼠血清皮質(zhì)酮水平（±s，μmol/L）

兩組比較，*P＜0.05；，#P＜0.01

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2.5 血清C反應(yīng)蛋白含量 第1周恐懼模型組血清hs-CRP濃度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），第2、3、4周恐懼模型組hs-CRP濃度非常顯著高于對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)表5。

表5 兩組大鼠血清C反應(yīng)蛋白水平（±s，μmol/L）

表5 兩組大鼠血清C反應(yīng)蛋白水平（±s，μmol/L）

兩組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

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3 討 論

諸多研究表明多種應(yīng)激都可以使動(dòng)物產(chǎn)生行為和情緒障礙[3]。恐懼應(yīng)激模型是根據(jù)經(jīng)典條件反射制造的一種模擬恐懼情感的動(dòng)物模型?？謶謼l件反射是指在一種明確的中性刺激（一般是光照或聲音）與一種惡性刺激（通常是電擊足底）之問(wèn)建立聯(lián)系，這種聯(lián)系建立與否可以用木僵行為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)[4]。目前條件性恐懼訓(xùn)練已經(jīng)成為一種經(jīng)典的誘導(dǎo)焦慮恐懼反應(yīng)模型的方法，被國(guó)外學(xué)者所采用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良的Takeuchi方法，發(fā)現(xiàn)條件恐懼應(yīng)激模型實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)的不同行為學(xué)變化，在噪聲后出現(xiàn)凍結(jié)姿勢(shì)：靜止、呆滯、蜷縮、蹲伏等，期間僅有呼吸和輕微搖擺運(yùn)動(dòng)，這些行為變化與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。以上所述行為的總時(shí)間稱為凍結(jié)時(shí)間，即條件恐懼模型組大鼠得分。本研究發(fā)現(xiàn)在連續(xù)3 d噪音+電擊刺激后恐懼模型組大鼠在第14天凍結(jié)時(shí)間顯著高于對(duì)照組，證明造模成功。

情緒變化會(huì)對(duì)體重產(chǎn)生影響，多項(xiàng)研究表明恐懼、抑郁、焦慮等情緒癥狀會(huì)引起厭食或貪食等飲食方面發(fā)生變化，最終引起體重的變化[6]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組大鼠體重均呈生長(zhǎng)狀態(tài)，但與對(duì)照組比較恐懼模型組體重增長(zhǎng)緩慢，提示恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)有一定影響。

自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)可用來(lái)測(cè)試動(dòng)物的活動(dòng)性和對(duì)新異環(huán)境的適應(yīng)能力[7]，一些研究已從分子水平探討應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響機(jī)制[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)恐懼模型組與對(duì)照組差異顯著。在第2周恐懼模型組休息時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，而活動(dòng)次數(shù)顯著低于對(duì)照組，第1、3、4周統(tǒng)計(jì)學(xué)差異小于第2周。表明恐懼應(yīng)激在第2周處于高峰期。

近幾年的研究已經(jīng)證明，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸在機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，應(yīng)激能夠激活 HPA軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)釋放糖皮質(zhì)激素以及交感神經(jīng)末梢和腎上腺髓質(zhì)釋放兒茶酚胺增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)第2周血清皮質(zhì)酮含量處于最高峰，第3、4周有下降趨勢(shì)，表明較長(zhǎng)時(shí)間恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠血清皮質(zhì)酮含量影響不同與短期應(yīng)激的變化趨勢(shì)，這與一些研究結(jié)果相符[10、11]。提示噪音加電擊已不能對(duì)大鼠造成新意額外刺激。

hs-CRP是一項(xiàng)敏感的炎癥反應(yīng)指標(biāo)，心理應(yīng)激能使炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子之問(wèn)的平衡破壞，造成免疫功能紊亂[12]。本研究顯示，隨著恐懼應(yīng)激時(shí)間的增長(zhǎng)，大鼠血清hs-CRP持續(xù)升高，表明恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠機(jī)體功能造成持續(xù)損傷。但本研究未從分子水平進(jìn)一步提示氧化應(yīng)激與炎癥之間的關(guān)系，尚待以后進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究建立了較為可信的大鼠條件恐懼應(yīng)激模型，并得出了恐懼應(yīng)激對(duì)大鼠一般行為及機(jī)體損傷指標(biāo)的損傷效應(yīng)，以期為抗恐懼應(yīng)激藥物評(píng)價(jià)提供可靠的依據(jù)。

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